EVs分离与表征
验证从hBMSCs培养上清中分离的EVs的形态、大小和标志物。
通过差速离心和超速离心从对照和SONFH hBMSCs培养上清中分离EVs，使用TEM、NTA和Western blot表征。
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来自激素性股骨头坏死患者骨髓基质细胞的外泌体低表达miR-182-5p加重疾病进展
Low miR-182-5p Expressing Extracellular Vesicles Derived From Human Bone Marrow Stromal Cells of Subjects With Steroid-Induced Osteonecrosis of the Femoral Head Aggravate Disease Progression
实验完整度
高包含体外细胞实验（增殖、凋亡、迁移、成骨分化）、体内小鼠模型（SONFH模型、EVs注射）、机制验证（双荧光素酶报告、Western blot）等多层级证据。
主要模型
SONFH患者来源的hBMSCs 对照hBMSCs C57BL/6小鼠SONFH模型 HEK-293细胞
重点核对
hBMSCs来自SONFH患者（5例）和股骨颈骨折对照（5例） EVs分离：差速离心+超速离心 SONFH小鼠模型：LPS（20mg/kg）和甲泼尼龙（50mg/kg）注射 EVs注射剂量：50μg/只，隔日一次，持续4周 miR-182-5p mimic/inhibitor转染浓度：100nM
摘要
激素性股骨头坏死（SONFH）是一种难治性、进行性疾病。然而，加重股骨头坏死的潜在机制仍不清楚。细胞外囊泡（EVs）在细胞间通讯中作为分子载体。我们假设来源于SONFH病变区域的人骨髓基质细胞（hBMSC）的EVs促进SONFH的发病机制。在本研究中，我们确定了SONFH‐hBMSCs来源的EVs在体外和体内对SONFH发病机制的调节作用。我们发现，hsa‐miR‐182‐5p在SONFH‐hBMSCs及其分离的EVs中表达下调。尾静脉注射转染hsa‐miR‐182‐5p抑制剂后分离的EVs加重了SONFH小鼠模型中的股骨头坏死。我们得出结论，miR‐182‐5p通过靶向MYD88并随后上调RUNX2表达来调节SONFH小鼠模型中的骨转换。我们进一步假设，来源于SONFH病变区域hBMSCs的EVs通过下调位于这些病变外部的hBMSCs分泌的miR‐182‐5p来加重股骨头坏死。我们建议miR‐182‐5p可为未来治疗或预防SONFH提供新靶点。© 2023美国骨骼与矿物质研究学会（ASBMR）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SONFH病变区域hBMSCs来源的EVs是否通过下调miR-182-5p促进SONFH进展及其分子机制。
- 核心机制
- miR-182-5p通过靶向MYD88的3'UTR抑制其表达，进而下调MAPK和NF-κB信号通路的磷酸化，并上调RUNX2表达，促进骨形成。
- 主要证据
- 体外实验显示SONFH-EVs抑制hBMSCs增殖、迁移和成骨分化，促进凋亡；体内实验显示SONFH-EVs和miR-182-5p抑制剂EVs加重小鼠股骨头坏死，而miR-182-5p mimic EVs改善骨小梁参数；双荧光素酶报告实验证实miR-182-5p直接靶向MYD88。
- 研究意义
- 研究表明miR-182-5p可作为未来治疗或预防SONFH的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
评估SONFH-EVs对hBMSCs活力、增殖、凋亡、迁移和成骨分化的影响。
用SONFH-EVs处理hBMSCs，进行活/死染色、BrdU掺入、Caspase-3/7活性、划痕愈合和茜素红染色实验。
体内分布与效应
检测SONFH-EVs在小鼠体内的分布及其对股骨头骨量的影响。
Dir标记SONFH-EVs尾静脉注射C57BL/6小鼠，24小时后IVIS成像；Control小鼠尾静脉注射SONFH-EVs或control-EVs，4周后μCT分析。
miRNA测序与机制探索
鉴定SONFH-hBMSCs中差异表达的miRNA，并探究hsa-miR-182-5p的作用。
对SONFH和对照hBMSCs进行miRNA测序，筛选差异miRNA；通过qRT-PCR验证miR-182-5p表达；通过Western blot检测信号通路蛋白磷酸化水平。
miR-182-5p功能验证
验证miR-182-5p对SONFH-hBMSCs功能及体内SONFH进展的影响。
在SONFH-hBMSCs中转染miR-182-5p mimic或NC，进行功能实验；将miR-182-5p mimic或NC注入SONFH小鼠，μCT和组织学分析。
MYD88靶向验证
确认miR-182-5p直接靶向MYD88，并验证MYD88在信号通路中的作用。
双荧光素酶报告实验验证靶向关系；MYD88 siRNA敲低后检测信号通路蛋白和Runx2表达；体内注射MYD88 siRNA后检测骨量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MSC无血清培养基 | Yocon | NC0103 |
| T175培养瓶 | Corning | 431080 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Procell | PB180329 | |
| EVs分离 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| EVs表征 | ZetaView仪器 | Particle Metrix | -- |
| EVs摄取实验 | PKH26 | Sigma-Aldrich | -- |
| 鬼笔环肽 | Abbkine | BMD00082 | |
| DAPI | Solarbio | C0065-10ML | |
| 8孔培养载玻片 | Ibidi | 80841 | |
| EVs分布实验 | Dir荧光染料 | Umibio | UR21017 |
| IVIS成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| RT-qPCR | Absolutely RNA微型制备试剂盒 | Qiagen | 74204 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 | |
| NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus | Novoprotein | e096-01A | |
| MX3005P荧光定量PCR仪 | Agilent Technologies | -- | |
| miRNA表达分析 | miRNeasy小型试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan通用PCR预混液II | Applied Biosystems | 4428173 | |
| TEM | 透射电子显微镜 | Hitachi | HT7800 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SDS上样缓冲液 | Epizyme | LT103 | |
| PVDF膜 | Epizyme | WJ001S | |
| CD9抗体 | Thermo Fisher Scientific | 10626D | |
| GM130抗体 | Cell Signaling Technology | 12480T | |
| CD63抗体 | Thermo Fisher Scientific | 10628D | |
| 磷酸化P38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| P38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 磷酸化Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| Erk1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| Runx2抗体 | Abcam | ab76956 | |
| MYD88抗体 | Abcam | ab133739 | |
| β-actin抗体 | Abcam | ab8227 | |
| ECL检测试剂 | Epizyme | SQ202 | |
| 动物实验 | 脂多糖 | Solarbio | L8880-10mg |
| 甲泼尼龙琥珀酸钠 | Pfizer Pharmaceutical | -- | |
| 啮齿动物繁殖饲料 | Huanyu | HD8015 | |
| Micro-CT | NEMO显微CT | Pingsheng | NMC-200 |
| 迁移实验 | 细胞培养插入件 | Ibidi | 80206 |
| Eclipse TS100显微镜 | Nikon | -- | |
| 凋亡检测 | Apo-ONE均相Caspase-3/7检测试剂盒 | Promega Corporation | G7791 |
| 活/死染色 | 钙黄绿素-AM | Sigma | 17783-1MG |
| 溴化乙锭二聚体 | Sigma | 46043-1MG-F | |
| 成骨分化 | 成骨分化培养基 | Cyagen | HUXMA-90021 |
| 茜素红-S染色液 | Beyotime | C0148S | |
| 免疫荧光 | 石蜡切片 | Leica | RM2016 |
| Histol（脱蜡剂） | Carl Roth | -- | |
| 乙醇 | SCRC | 100092183 | |
| HE染色 | HE染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| 转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | 13778075 |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 | |
| 双荧光素酶报告 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| pMIR-REPORT荧光素酶载体 | Promega | -- | |
| phRL-TK载体 | Promega | -- | |
| HEK-293细胞 | Procell | -- | |
| miRNA测序 | TruSeq小RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina HiSeq 2500测序平台 | Illumina | -- | |
| 统计分析 | Prism 8.02软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | hBMSCs来源：SONFH患者5例（平均年龄49.6±10.1岁）和股骨颈骨折对照5例（平均年龄68.2±5.7岁）；培养代数P3；MSC无血清培养基（Yocon） 阅读提示：Methods: Isolation and characterization of control hBMSCs and SONFH-hBMSCs |
| EVs分离 | 差速离心：300g 10分钟、2000g 10分钟、10,000g 30分钟；超速离心：120,000g 70分钟；0.22μm过滤；PBS重悬 阅读提示：Methods: Control-EVs and SONFH-EVs isolation |
| SONFH小鼠模型建立 | C57BL/6雄性8周龄；LPS 20mg/kg肌注3次（间隔24小时）；甲泼尼龙琥珀酸钠50mg/kg连续7天；对照组PBS 50mg/kg连续10天；4周后取材 阅读提示：Methods: Establishment of the SONFH mouse model |
| EVs体内注射 | EVs剂量50μg/200μL PBS；尾静脉注射，隔日一次，持续4周 阅读提示：Methods: Establishment of the SONFH mouse model |
| miR-182-5p干预 | mimic/NC注射剂量6mg/kg；尾静脉注射，每3天一次，持续2周；体外转染浓度100nM 阅读提示：Methods: Establishment of the SONFH mouse model; hsa-miR-182-5p overexpression and knockdown |
| MYD88敲低 | siRNA浓度10μM（体外）；体内注射10μg siRNA/只，每周两次，持续4周 阅读提示：Methods: MYD88 knockdown in SONFH-hBMSCs and in the SONFH mouse model |
| Micro-CT分析 | 分辨率9μmol/L；参数BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp 阅读提示：Methods: Micro-CT analysis |