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实验问答

28,911,907 科研人在看

问染色质消化不足且片段过大（大于 900 bp）怎么处理？

丁香实验

①确定甲醛浓度，将交联时间缩短至 10 分钟或更短。②在交联之前计算平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；③适当延长染色质消化时间。

1 回答477 围观

问消化的染色质浓度过低怎么处理？

丁香实验

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。②在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。

1 回答627 围观

问为什么我的ChIP实验做出来，结果就是不理想呢？为得到理想的ChIP结果，怎么优化实验条件？

丁香实验

1、染色质的制备：为了获得足量的染色质，我们的样品准备一定要充足。（IP实验的损耗较大，为保证实验用量，一次准备5×10E7个以上细胞较好）2、优化交联固定条件：ChIP实验成功与否，直接取决于染色质完整性、抗原表位质量和抗体特异性（抗体一定买好的）。因此优化交联固定条件，富集丰度更高。3、优化染色质片段化条件：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染色质样品至关重要。（推荐的片段化程度

1 回答851 围观

问MS到底能不能实现ip后pg级别的蛋白组学分析？

丁香实验

pg级别鉴定是问题不大。问题有几点。主要判定依据是你ip下来的内源性蛋白在整个样品中有没有可能超过鉴定的下限。理论上10万细胞不算少，实际也是对应蛋白质组学而言。但是考虑到你ip的条件，目标蛋白的内源性丰度，非特异结合的蛋白的情况，不能下定论能不能鉴定到。建议尝试。

1 回答956 围观

问血浆提取RNA用于跑QPCR跑不出的原因？

丁香实验

血浆 -是将新鲜血液加抗凝剂后离心析出的上清液.（血细胞沉降下去了），血液提取RNA 应该是在白细胞中提，首先血液中的RNA本身就少，血浆中的RNA很有可能是白细胞破裂析出的部分，自然更少，前提是不是要搞清楚rna是从血液中的哪里提出

1 回答2219 围观

问RNAi用于检验,可行吗？

hzdlj

上几周开会的时候听见了中山二院的宋尔卫研究员讲的RNAi干扰技术,加上我一直很感兴趣,也在看一些文献.会上,我请教过他这个问题,宋老师说他还没有想过这个问题(宋老师很谦虚,听他的讲座受益非浅),不过他向我说起了一个实验模型,就是把siRNA固定在一个固相载体上,然后加入肿瘤细胞,当然siRNA是针对肿瘤细胞的耐药基因设计的,培养细胞加入化疗药物,观察哪些细胞成活了,成活了的,显然不携带耐药基因,没

3 回答789 围观

问都说RNAi很容易降解，转染效率很低。一般采用什么策略和技术来防范呢？

丁香实验

RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后

1 回答1138 围观

问细胞培养中霉菌污染问题

丁香实验

1.细菌污染液体混浊,霉菌污染可看见霉苔但液体不混,所以你的细菌和霉菌同时污染处理:扔掉,以免污染其他细胞2.你说的线状生长实际上细胞已经接近死亡3.可以将培养箱用75%的酒精擦拭,并停止细胞培养,然后用紫外消毒房间

1 回答742 围观

问细胞复苏失败的原因分析

丁香实验

juventus2004认为复苏过程没有问题，是否是从液氮拿出直接放入温水，还有培养箱，二氧化碳浓度，培养基、PH值等环节。要么加高浓度FBS 15-20%，看看能否帮助贴壁，当然也需要考虑血清问题，还有确信拿来的细胞没问题。pcspc9认为首先应该怀疑冻存，实际上复苏出问题的可能非常小，因为操作简单，而且死板。1、你冻存的时候是不是消化的时间过长，这是一般人所注意不到的，即使书上也不讲这个问题，

1 回答1353 围观

问如何观察细胞污染？

丁香实验

观察细胞污染首先要从培养液的外观来看，看培养液是否清亮。当然，刚刚加入培养液是看不出来的。必需经过隔夜培养或更长时间才能看出来。如果培养液变混浊，则可断定细胞污染。其次，是从显微镜下观察，因细菌很小，所以观察时眼睛盯住一个视野，你会看见细小的黑点在动，细胞是不会动的，因此，可以断定那就是细菌。以上是小可培养细胞来观察污染的一点体会，仅供参考。不过以上情况还是少见或不见好，那就表明你的细胞养的好。

1 回答3429 围观

问诱导表达不出蛋白

ZhangDss

后来实验室的老师建议我用BL21（DE3）plys表达，现在还在试，不知道是不是菌种的原因。

3 回答700 围观

问蛋白表达自动诱导系统以及大幅度提高产量

lithlin00

包含体的形成与否与普通IPTG诱导的结果相当，我经验看来，可溶性的效果上可能还好些，因为乳糖的诱导不同于IPTG，它要经过好几个过程，同时它又是碳源之一，所以它的诱导是很温和的一个过程，而IPTG是很剧烈的一个过程，浓度高的时候，蛋白的折叠速度就会跟不上表达速度，导致包含体的形成。我在IPTG诱导时的两个可溶性蛋白，在5052系统中也是完全可溶的。我一直用的Rosetta(DE3)plys，你应该

4 回答997 围观

问能否在一个表达载体里插入两个蛋白实现同时表达

dupli

完全可以，楼主所说共表达不是融合表达，是共同表达。如果是真核表达，把两个表达框构建到一个载体上进行转化或转染就可以实现共表达了,有一些现成的用于共表达的载体。动物细胞中还有IRES载体可用于共表达。如果是大肠杆菌或其他原核生物共表达，可以构建两个顺反子到一个载体上，但是步骤可能会比较多，载体比较大，可能会影响质粒复制而影响表达效果。而如果两个顺反子有较大同源部分，则还需要考虑因重组导致的不稳定。N

3 回答3774 围观

问RT－PCR在RNA干扰中是否还有作用？

zhuqueleee

我觉得你的方法有点问题的。你不应该仅仅通过观察RNAi前后实验组、空白组的cDNA含量变化来监测RNAi效果，而是应当把空白组和实验组再各设一个看家基因对照，通过看家基因和目的基因的量的对比，从而观察你的RNAi效果。个人意见，希望对你的实验有所帮助。

3 回答959 围观

问怎样用流式细胞仪来鉴定小鼠BMDC？

丁香实验

检测小鼠BMDC主要是从形态学和细胞表面分子两方面来鉴定我做的时候就做了普通光镜下形态、电镜（扫描和透射），另外检测了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。还做了MHC II类分子的检测，还有MHCI类分子的检测，这些分子在DC表面都不是特异存在的，在巨噬细胞、淋巴细胞表面也有表达，所以目前并没有非常特异性的方法检测你的细胞一定就是DC，但是从形态和表面分子的检测结合来看，效

1 回答1123 围观

问RNA提取中的问题

老鹰归来

75%的乙醇哦亲，室温即可哦亲。配置75%乙醇的水必须经过DEPC处理哦亲。原理：之所以用乙醇是为了让RNA析出哦亲，之所以不用纯乙醇而用75的乙醇是为了溶解RNA提取过程中的胍盐等可溶杂质哦亲，用纯乙醇而不用75的乙醇洗涤RNA会导致最后260/230的比值小于2.0哦亲。260/230低于2.0可以做反转，定量，但是不可以用于测序哦亲。提问者：那也就是说最后一步非要用带水的乙醇对吧，其实真正起

2 回答2103 围观

问RNA提取，rtPCR和qPCR碰到的问题

wangqing2020

取完一个标本后，趁研钵还是很冷的状态下，向研钵中加一勺（用不锈钢的小汤勺即可）液氮，立刻用研棒搅动样品，趁样品飘在液氮中，将样品和液氮一起倒到锡箔纸做成的小碗中（用来收集废样，便于丢弃）。如果一次洗不干净，可以多洗两遍，我都是这样做的，一般洗两次就很干净了。

2 回答2363 围观

问如何灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解？

丁香实验

以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：（1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。（2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活（3）立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection：RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未

1 回答2739 围观

问细胞胞质疏松，状态不好，养不起来怎么办?

丁香实验

——解决办法1：一般情况下，从血清下手就行，要么换好血清，要么提高血清浓度，血清浓度提高到 15%～20% 培养 48 h，换成正常 10% 的浓度，用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性。——解决办法2：血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法，从培养瓶换到六孔板，12 孔板等，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。——预防办法：细胞胞质疏松，老化的原因在于细胞

1 回答973 围观

问引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

zcldf001

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o

1 回答1502 围观

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