实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问【求助】泛素化出不来！

卡戎3521

反过来拉，用ha抗体做诱饵蛋白，fkag显色。。我开始就是转myc/his-Ub质粒跟Flag-A蛋白的质粒，使用Flag做诱饵蛋白，但是每次都搞不出来。。后来看了很多文献，有的就是用Ni直接拉His这种方法，我用类似的His抗体做，成功率就还可以，目的蛋白的上方有多个条带，对照里面就没有~~

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问一个质谱结果想请教大家如何分析

黑糊糊2000

这结果应该是PD sequest search result。我们从来不用score。都是PSM vaule. 你的结果是IP 那应该和negative control 比。但是你要注意low psm 不代表这个就是 false positive. 因为这个ＰＳＭ和蛋白长度也相关所以低PSM 不见的就不好。IP 的结果一般你的bait 会有最高的PSM 有时候也会是heatshock 或者 ri

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问求PCR结果怎么做出这样的散点图

seuzsl

先求每个样本的2的-Δct，然后所有结果除以对照的均值，就可以作图了

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问qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

seuzsl

理论上讲不同样本内参Ct值的差异并不影响结果解释，因为对于同一个样本而言，目的基因ct-内参ct应该是一个常数，而在提取RNA时，取样量（即，细胞数）存在差异会导致得到的RNA总量有差异，即便通过细胞计数取了等量的细胞，提取时RNA的得率也不同，即便取了相同质量的RNA进行逆转录，不同样本间降解程度、其它rna表达水平都可能会导致内参ct存在差异（当然这种差异不应该很大），这就是为啥一定要做内参，

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问如何进行QPCR中多组数据的统计分析？

香柏树001

相对表达量，我用的是2-△△CT法，每组3各平行要有的，然后得出的Ct值，计算出2-△△CT值就可以了，这样就得出3各2-△△CT，要比较的两组之间求P值就行了。附件讲的比较详细。

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问为什么目的基因Ct值正常，反而内参的Ct值很高

杜小涛

引物反复冻融次数多了就有可能降解，不过你这个可以先考虑基因时空表达的问题，如果确定你做的这个时期和组织确定表达量并不低，就有可能是引物反复冻融导致的降解了

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问外周血单个核细胞（PBMC）

丁香实验

破骨细胞没诱导培养过，刚看了下资料，猜测你估计是用血液单核细胞诱导法诱导分化培养，这个就需要贴壁的单核细胞，单核细胞是半贴壁的细胞，可以只加培养液不加血清诱导因子于培养箱孵育1-2h，然后用PBS慢慢清洗去除不贴壁的淋巴细胞和其他杂细胞杂质等，这样六孔板下单核细胞纯度就高了，看了你这图片，铺板密度有点低啊，以前做过2-undefined10^6/ml铺孔PBMC分离单个核细胞，然后洗涤纯化，单核纯度很高。然后加

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问大家来谈谈95D,95C的培养心得吧

丁香实验

谢谢评论，今天36h，细胞在10cm皿和六孔板里全死了。我估计消化确实有问题，但是不知道到底是消化过度还是消化不足。同时养的A549、293T贴壁也不好。12h了，贴壁后形态还是圆的，贴壁不稳当

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问【求助】ChIP超声条件摸索

丁香实验

还有，一般超声片段范围在200_1000比较好，其实200_2000也是可以接受的，只要能保证70%以上在这个范围，就可以了！

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问低丰度表达的蛋白做WB有什么好方法吗？

丁香实验

低丰度蛋白用WB检测的确会有些困难，但第二张我看到目的条带了，既然丰度低就意味着非特异性结合会提高，我建议你有两点：1，二抗浓度的把握要精准，在能呈现目的条带时降低二抗非特异性结合的概率2增加Tween-20的工作浓度，用更改过的工作浓度去配置TBST清洗，背景的效果可能会改善不少，自然而然目的条带也会展现出来了。

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问CHIP超声后DNA浓度上不去，求助大神

xue454962321

按照CST9005试剂盒描述是抽提了细胞核，之后Micrococcal Nuclease酶切是在保证细胞核完整的状态下做的，离心之后需要的是沉淀（细胞核），这个时候上清里面是没有东西的，因为细胞核还没有被破膜；之后再把细胞核沉淀裂解，用超声的方法帮助破核膜，在离心取上清。此时，蛋白和核酸都应该在上清里面。如果你提取的是Micrococcal Nuclease酶切之后的上清，那应该就是没有DNA的；

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问WB 点样孔有残留，跑出的条带就变形了，这是怎么回事呢

丁香实验

我老师说出现这种情况在水浴5-10分钟试试

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问ChIP中input的问题

bob523740605

我最后做的是Qpcr ，数据分析的时候是一input为基准的分析，通过一个excel表分析http://http://d.dxy.cn/detail/4076728

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问【原创】Western blot 之制胶技巧，易翻车点及其解决方法汇总

丁香实验

说到WB制胶，相信很多同志都有说不尽的"翻车"故事。俗话说的好，工欲善其事必先利其器，SDS PAGE凝胶就是我们做WB要利的器，因为高质量的胶是跑出漂亮条带的重要前提之一。今天我们就来探讨一下制胶这个事。一、SDS PAGE 凝胶制备1、玻璃板梳子的清洁先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或

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问wb 小白求助 E-cadherin 和 N-cadherin 转膜条件和分子量是多少？

丁香实验

E-cadherin是135，一抗的话我们是4℃。转膜的话，我们是恒流，300mA，90min左右

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问染色体免疫共沉淀实验求助，那个proteinA/G是怎么回事？

丁香实验

别买磁珠需要相应的仪器来做磁珠肯定方便些的还有就是珠子不容易吸走背景好点噪音小不过细心点用普通的beads 离心也就可以了

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问【求助】PCR实验目的基因的CT值和内参的CT值接近

冰雪芙儿

CT值高，提高模板浓度就行了，我最近也在做，刚开始稀释发现CT值很高，不稀释就好了

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问PCR 结果

午后的红太狼

感觉是因为你提出来的RNA量太少的缘故，从你的内参的CT值可以看出来，可能你要检测的基因本来表达量就不高，内参的CT值不够低的时候，你的目的条带就扩不出来了，大概的看了一下，目的基因有值的那几个，基本都是内参测得比较低的几个，所以建议RNA多提一点，多逆一点，把内参的CT值降到20以下就差不多了

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问【求助】PCR 产物在加样孔里跑不出来怎么回事

xuyongbin

我也曾经遇到这种情况，后来把产物稀释100倍还有，最后我把产物稀释1000倍。取0.5ul，把退火在温度在原来基础上提高2℃就好了，可能是模板量太大的原因。

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问PCR产物电泳条带

sakeiiii

会不会是模板有问题，RNA跑胶了吗？后面这个应该是二聚体或者非特异性扩增？也可能引物有问题

1 回答321 围观

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