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        RNA提取,rtPCR和qPCR碰到的问题

        相关实验:RNA提取及检测

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        firekirin

        各位前辈好,本人初入此门,仍在不断学习,遇到些问题,也曾google,不得要领,来此求助,希望前辈不吝赐教。万分感谢。 RNA提取(Trizol法) 1. 主动脉中提取RNA,使用液氮研磨,在加入下一个标本前,如何清洁研磨? 2. 有何办法尽量多取到组织粉末? 3. 实验室里也有SPEX的液氮冷冻研磨机,但感觉不好用,组织标本粘在小管壁上,不磨碎,也取不出,有用过这种机器的前辈请指教。 4. 提取的RNA浓度,各标本间差异大,少的10几ng/ml,多的100ng/ml,低浓度的标本反而260/280的值更高到1.80,高浓度的在1.60,这会影响后面的rtPCR吗?如何处理呢?。 rtPCR 5. 我没有把RNA调到相同浓度就做了逆转录成cDNA,要继续做qPCR,可以参照RNA的浓度稀释cDNA吗? qPCR 6. 做qPCR同时,会做housekeeping gene,想看某药物对基因的调节作用,如果该药物也影响housekeeping gene,是不是实验结果就会很混乱? 也许问题比较多,也比较幼稚,还请包涵,再谢了:)
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        2 个回答

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        wangqing2020

        有帮助
        取完一个标本后,趁研钵还是很冷的状态下,向研钵中加一勺(用不锈钢的小汤勺即可)液氮,立刻用研棒搅动样品,趁样品飘在液氮中,将样品和液氮一起倒到锡箔纸做成的小碗中(用来收集废样,便于丢弃)。如果一次洗不干净,可以多洗两遍,我都是这样做的,一般洗两次就很干净了。
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        wangqing2020

        有帮助
        1、用液氮冲洗一下,没有上一个标本的残留就可以了。 2、用小药匙取粉末很方便。需要先将小药匙在180度烘6小时以上,用时在液氮中预冷。 3、曾经试用过液氮冷冻研磨机,发现不如研钵好用,一是大部分组织样品磨不碎,二是大部分组织粘在了管壁上,很浪费。 4、自我感觉260/280的值在1.6-1.9之间都没问题,可以直接往下做。 5、cDNA可以不用稀释,因为有内参,模板多,内参值就会大;模板少,内参值就小,结果是一样的。 6、可以预先多选几个housekeeping gene做个小实验,挑选1个不受该药物影响的housekeeping gene做为qPCR的内参就可以了。
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