实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问CD25磁珠分选纯度很低的原因，如何处理？

莹啊免疫啊

可能是磁珠的特异性不够或者量不够，或者是你是两个一起分选的还是分步分选的，一起分选的话，CD4+本身可能就带了一些25+和25-导致结果不好？个人推荐可以试试流式分选，多重筛选还挺省事的。

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问磁珠分选和流式分选的问题

dxy_29k93ve4

磁珠分选一般是细胞数比较多，如果流式分选时间会很长，磁珠分选可以较短时间拿到比较多的细胞；流式分选会时间相对较长，同时分选过程会给液滴加电，以及如果液体打到收集管侧壁都会对细胞造成损伤，但是可以同时多标进行分选，磁珠分选就做不到

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问如何检测人的肝脏内免疫活性细胞(调节性T细胞或自然杀伤性T细胞)的数量和功能?

西柚味的芋圆

流式的方法应该是可以的可以通过流式的方法去检测人穿刺的肝脏样本中免疫细胞的活性。先剪碎组织，用0.5mg/ml collagenase IV 消化 37℃ 30min。消化之后过滤离心，裂红。得到免疫细胞之后就可以计数。利用流式抗体，可以检测Treg和NK细胞的细胞因子如TNF-a IFN-gamma等。但是这些胞内因子的检测需要加刺激计，对细胞数量和活性都有一定的要求

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问ELISA抗原包被问题

西柚味的芋圆

4度过夜(指12h)包被效果不太好. 包被抗原浓度不确定,没定量,可能你的蛋白量太少(最有可能) 没有封闭的步骤一抗稀释倍数不清你的洗涤影响不会很大,一般没问题.

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问用免疫荧光的方法检测 LC3 可以么？怎么计算？

西柚味的芋圆

免疫荧光染的是会同时染LC3I 和II 的，这种方法也没问题，在正常细胞和受刺激的细胞中都会有LC3的光点，二者的区别是受刺激的成团块状，正常的呈散点状。。。在一些可能会影响LC3的翻译的条件下，可能受刺激的细胞表现为光点也会变多，这个好理解。。。而在自噬基础水平比较低的状态，给了刺激可能也看不出太大区别时可以考虑转染，相当于给个放大镜，放大这一过程。

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问到底用石蜡切片还是冰冻切片做免疫荧光效果更好？为什么？怎么选择？

莹啊免疫啊

石蜡切片免疫组化，冰冻切片免疫荧光，冰冻快，新鲜，石蜡好保存，麻烦，有些一抗不能用于石蜡切片

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问流式与werstern的区别？

sk1981521

1、Western 是检测蛋白表达的金标准，可用于检测细胞多种类型的蛋白；流式细胞术的方法多用于检测细胞膜蛋白，虽然也可通过Triton-X100给细胞打孔的方法来检测胞内蛋白，但对于分泌蛋白却是无能为力的； 2、Western测蛋白含量对抗体的量需要很少，一般1：1000左右，而流式对抗体的需要量很大，一般1：50（很浪费抗体）； 3、采用Western方法检测细胞蛋白含量的变化一般要有内参，而

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问流式细胞仪检测细胞凋亡结果分析问题

莹啊免疫啊

感觉分群分的不太好，至少得重复三遍才行，试试看第二遍时候会不会好一点。

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问如何有效提升特异性荧光染色的方法？

lyang556

用石蜡包埋，然后切片尽量切薄（3μm），可使细胞轮廓清晰。用0.1%硼氢化钠室温处理20分钟，然后0.5%苏丹黑室温处理3分钟，以降低自发荧光。

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问实验OD值偏差问题，想知道哪里出错误了

颜渊溪桥

首先前提是标准曲线做的没有问题，那么第二次的样品需要稀释后检测呢，是否样品中的本来前胶原含量就比较多。

9 回答455 围观

问请问elisa实验中，空白、阳性对照、阴性对照均显色，可能是什么原因？

sfnana

您好，楼主，请问你的问题解决了吗？我现在也是出现了跟你一样的问题，阴性，空白值都很高。（我做的是双抗体夹心，biotin标记的抗体 1：1000 100uL/孔，亲和素1：5000）样本（O.D.450 nm）阴性（O.D.450 nm）空白（O.D.450 nm） 2.5310

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问细胞免疫荧光探讨

旅途中的搬运工

我最近也在做，做了好几次甩片了，准备试试在流式管或者EP管里面固定加染色了，做完最后一步再甩片了。甩片完了在固定，细胞形态会改变，结构可能也完整

4 回答1428 围观

问流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙？

LM0309w

1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。2、流式同型对照怎样选择？同型对照（IsotypeControl）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以

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问DNA、mRNA和蛋白质–这是一个悲伤的故事

7月未央

哭着哭着，蛋白就水解了。（= =|||||||||||||||||）DNA终于又转录了一个mRNA。DNA说：“你好，我是你的模板。”mRNA说：“你好，我是mRNA。”DNA仔细地看着mRNA：“你和他，真是一模一样。”mRNA：“谁？”DNA：“我上一次转录的mRNA。”停了停，又说：“你们明明是一样的，为什么我还在想念他呢？”说完，DNA慢慢合上了眼睛（…）。如果相遇的尽头注定是错过，是不是

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问DNA琼脂糖凝胶电泳关于上样的问题

mpark

For DNA with size less than 150 bp, try to run native PAGE, DNA over 200 bp, try to run 2% agarose gel (60V for 30 minutes). If you want to run 4% agarose, try to use low melting temperature agarose i

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问PCR扩增不出DNA

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

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问咨询一下关于质粒的问题

realtimes

OD测定没有电泳准，电泳可见即所得，OD有不一定有质粒

3 回答414 围观

问DNA的分子量估算

ajun333333

核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28

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问培养液分泌蛋白质谱前处理

青木书生

非标，具体原理你可以去看看我之前的帖子。你这个实验，前期定量在这个实验里面非常重要，毕竟全蛋白如果TIC差距过大，normalization还有个内参蛋白参考。建议送样前跑胶定量。DTT，IAA的母液可以使用10mM-50mM的NH4HCO3溶液，也可以用水配母液。具体工作浓度varies a lot by studios,自查JPR或者MCP文章。IAA注意避光配置，避光孵育，不宜反应时间过长。

2 回答761 围观

问【求助】泛素化出不来！

卡戎3521

反过来拉，用ha抗体做诱饵蛋白，fkag显色。。我开始就是转myc/his-Ub质粒跟Flag-A蛋白的质粒，使用Flag做诱饵蛋白，但是每次都搞不出来。。后来看了很多文献，有的就是用Ni直接拉His这种方法，我用类似的His抗体做，成功率就还可以，目的蛋白的上方有多个条带，对照里面就没有~~

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