实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问AAV病毒纯化方法及感染细胞的实验方法，及相关注意问题？

丁香实验

AAV的纯化1）向病毒浓缩液中添加固体 CsCl 直到密度为1.41 g/ml（折射率为1.372）；2）将样品加入到超速离心管中，用预先配好的 1.41 g/ml CsCl 溶液将离心管剩余空间填满；3）在 175,000 g 下离心24 小时，以形成密度梯度。按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有AAV 颗粒的组分；4）重复上述过程一次。5）将病毒装入100 k

1 回答1144 围观

问病毒做TCID50确定滴度的问题

丁香实验

如果有cpe而没有荧光，应该修饰区域的丢失。我之前遇到过这种情况。

1 回答988 围观

问为什么病毒纯化中peg6000沉淀不能溶解？

丁香实验

自己做个结论，是资料上使用的离心机和我使用的离心机不一样，我使用的相同转速，离心力要大于资料上的，在做了离心力换算，调整转速后，问题解决了。所以，以后看见资料上写转速的，一定要小心了，很可能就是一大坑。

1 回答1933 围观

问关于RNAi转染效率的问题

丁香实验

不知道你是采用反义核苷酸还是siRNA，是直接导入anti－sense或者siRNA片段还是采用构建干扰质粒的方法，如果是直接导入寡核苷酸片段，只能采用特定的干扰转染试剂，推荐Ambion公司的转染试剂，如果是构建的干扰质粒，则可以采用质粒通用转染试剂，比如罗氏的FuGENE 6，效果不错。上述两种试剂都可用于普通质粒转染，优点是操作程序简单，尤其是Ambion的细胞毒性小。我做过许多细胞株，包括

1 回答741 围观

问transwell试验细胞计数

丁香实验

1. 一般会用相同的面积孔板，摸索24小时长满的细胞的接种量。2. 铺时，吸掉原来的培养基，我们做侵袭实验时，两种细胞所用的培养基不一样。3. 上室细胞背面计数：先用4%聚甲醛固定，清洗后，用吉姆萨染色，染色后，就能在显微镜下选择10个视野进行计数。

1 回答1458 围观

问如何准确的细胞计数方法？

丁香实验

如果你要做别的，我不好说，如果做RNA提取，不必太紧张，RNA提取很容易的，对细胞数的要求也不必太严格，可以说很松地依经验加上1-2ml裂解液就可以了，有你计数的功夫，RNA可就变质了，要记住，RNA在生长活跃的细胞中最好，任何的温度，渗透压等因素改变都会影响ＲＮＡ的，这个过程可很快。所以，不要消化，洗涤，和计数、，直接把裂解液加上就可以了，经验比说明书更管用！！1.我讲过“有计数的功夫，RNA就

1 回答792 围观

问细胞冻存液DMSO浓度是10％还是20％？

丁香实验

DMSO不能超过10%，因为有细胞毒性，一般都采用10%，血清一般用30%到40%，当然再多一点血清也没有坏作用，只是浪费而已。一般来说，DMSO：血清：培养基的体积比为1：3：6或1：4：5。冻存液最好现配现用，不易放的时间过久（一般不超过一个月）。但刚配好的冻存液会产热，需放置一会才能用于悬浮细胞。冻存细胞（以50ml培养瓶）时，先将冻存液按DMSO：血清：培养基的体积比按1：4：5配好，再处

1 回答3380 围观

问原核生物与真核生物翻译起始阶段有何异同？

丁香实验

相同之处：（1）都需生成翻译起始复合物；（2）都需多种起始因子参加；（3）翻译起始的第一步都需核糖体的大、小亚基先分开；（4）都需要mRNA和氨酰- tRNA结合到核糖体的小亚基上；（5）mRNA在小亚基上就位都需一定的结构成分协助。（6）小亚基结合mRNA和起始者tRNA后，才能与大亚基结合。（7）都需要消耗能量。不同之处：（1）真核生物核糖体是80S（40S+60S）；eIF种类多（10多

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问细胞培养的前期工作准备有哪些？比如器皿的消毒处理？

东月来星

我无聊跟你说说吧，1. 离心管、头、棉球、培养瓶、玻璃容器等需要消毒处理吗？高压还是浸泡？离心管、头之内的高压灭菌即可。棉球用酒精配。培养瓶和玻璃容器可以泡酸洗涤在高压。具体酸的配方论坛里就有。配个次强酸就行。可以用好久的。注意安全就好。2、血清需要过滤吗？还是需要怎样处理？不用过滤。关于灭活论坛里看法不一，自己收收看，自己选择。3、PBS配置后需要高压吗？高压，不高压，细胞污染了咋办。4、

1 回答779 围观

问如何提高DNA提取纯度？

丁香实验

手工可以用吸附柱，全自动用磁珠的比较多。一般来说柱提法要比磁珠法提取的纯度要高，楼主还是换用柱提法的试剂盒吧，QIAGEN，天根，百代BIOG都有柱提法的试剂盒。

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问人工提取血凝块DNA，捣碎血凝块有什么好方法？

丁香实验

1.可以用纤溶酶处理, 比如tPA,2.或者直接用小的玻璃匀浆器研磨,3.很奇怪,血凝块中的血小板和红细胞是主要成份,有核细胞少的很,你如何这样提DNA, 为什么不用血液或其它组织来提

1 回答403 围观

问如何检测两个蛋白质相互作用的强弱？

丁香实验

免疫共沉淀Co-IP。1. 转染，A与WT/MUT分别共转细胞；2. 裂解后，用anti-A抗体与lysates孵；加入结合抗体的proteinA/G beads结合；3. 洗beads。4. 洗脱。5. WB，观看结合在beads上的A,B多少。A做内参control。看结合的B的差别。

1 回答850 围观

问染色质消化不足且片段过大（大于 900 bp）怎么处理？

丁香实验

①确定甲醛浓度，将交联时间缩短至 10 分钟或更短。②在交联之前计算平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；③适当延长染色质消化时间。

1 回答329 围观

问消化的染色质浓度过低怎么处理？

丁香实验

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。②在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。

1 回答426 围观

问为什么我的ChIP实验做出来，结果就是不理想呢？为得到理想的ChIP结果，怎么优化实验条件？

丁香实验

1、染色质的制备：为了获得足量的染色质，我们的样品准备一定要充足。（IP实验的损耗较大，为保证实验用量，一次准备5×10E7个以上细胞较好）2、优化交联固定条件：ChIP实验成功与否，直接取决于染色质完整性、抗原表位质量和抗体特异性（抗体一定买好的）。因此优化交联固定条件，富集丰度更高。3、优化染色质片段化条件：要得到理想的ChIP结果，合适长度和浓度的染色质样品至关重要。（推荐的片段化程度

1 回答650 围观

问MS到底能不能实现ip后pg级别的蛋白组学分析？

丁香实验

pg级别鉴定是问题不大。问题有几点。主要判定依据是你ip下来的内源性蛋白在整个样品中有没有可能超过鉴定的下限。理论上10万细胞不算少，实际也是对应蛋白质组学而言。但是考虑到你ip的条件，目标蛋白的内源性丰度，非特异结合的蛋白的情况，不能下定论能不能鉴定到。建议尝试。

1 回答650 围观

问血浆提取RNA用于跑QPCR跑不出的原因？

丁香实验

血浆 -是将新鲜血液加抗凝剂后离心析出的上清液.（血细胞沉降下去了），血液提取RNA 应该是在白细胞中提，首先血液中的RNA本身就少，血浆中的RNA很有可能是白细胞破裂析出的部分，自然更少，前提是不是要搞清楚rna是从血液中的哪里提出

1 回答1917 围观

问RNAi用于检验,可行吗？

hzdlj

上几周开会的时候听见了中山二院的宋尔卫研究员讲的RNAi干扰技术,加上我一直很感兴趣,也在看一些文献.会上,我请教过他这个问题,宋老师说他还没有想过这个问题(宋老师很谦虚,听他的讲座受益非浅),不过他向我说起了一个实验模型,就是把siRNA固定在一个固相载体上,然后加入肿瘤细胞,当然siRNA是针对肿瘤细胞的耐药基因设计的,培养细胞加入化疗药物,观察哪些细胞成活了,成活了的,显然不携带耐药基因,没

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问都说RNAi很容易降解，转染效率很低。一般采用什么策略和技术来防范呢？

丁香实验

RNAi中，标准的非修饰的siRNA确实容易降解，这不仅在保存过程中，而且在转染过程中。对siRNA的降解，可以合成修饰的双链siRNA，以提高合成中的稳定性，使用合成好的siRNA，尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说，因为要接触血清，培养基以及细胞内酶的作用。这时，好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时，保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响，同时在进入细胞后

1 回答635 围观

问细胞培养中霉菌污染问题

丁香实验

1.细菌污染液体混浊,霉菌污染可看见霉苔但液体不混,所以你的细菌和霉菌同时污染处理:扔掉,以免污染其他细胞2.你说的线状生长实际上细胞已经接近死亡3.可以将培养箱用75%的酒精擦拭,并停止细胞培养,然后用紫外消毒房间

1 回答530 围观

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