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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
组织切片免疫荧光双标法染色,背景异常的问题?
dxywode
1.适当延长封闭时间,每次洗涤时要充分(个人认为这点洗涤很重要,不是洗的时间足够长就可以的,比如15miundefined3次就不如5miundefined5次),尽量减少非特异性染色;2.切片尽量薄3。共聚焦拍照的话,配套软件很好,可以修得很漂亮
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问
免疫细胞培养的上清液除了用ELISA检测,还听说可以用mRNA检测手法,但是对于上清分泌的细胞因子如何收集,如何处理检测?
lzy必有我师
一般检测上清都是用ELISA方法检测啊,简单实用,结果重复性也还可以,没有必要用什么更高级的方法。培养液浓缩用超滤好了,但是真核细胞表达量比较低,比较麻烦。
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问
染色细胞核发灰模糊,对比不鲜明的原因有哪些?
师医生说
HE染色,在染色过程中出现有发挥和模糊的情况是很常见的。尤其要注意苏木素染色的时间,同时要注意染色液的周边环境和是否有结晶存在,同时,在整个染色过程中,要严格把握无水乙醇及不同浓度乙醇是否挥发及脱水分化返蓝的整个过程,大量的流水冲洗时间一定要够,要正确使用透明剂。同时,如果是新换的染色液要对片子首先进行预染色。
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问
请问有大佬知道混合淋巴细胞反应(单侧),用丝裂霉素处理时,其剂量用多少?
lzy必有我师
间歇用药法 4-6mg/日,每周静脉注射1-2次。连日用药法2mg/日,连日静脉注射。 大量间歇用药法 10-30mg/日,以1-3周以上间隔静脉注射。 与其它抗肿癌药物合用 2-4mg/日,每周1-2次。 必要时也可以2-10mg/日,注入动脉、髓腔或胸、腹腔。膀胱肿瘤 预防复发时,4-10mg qd或隔日注入膀胱;治疗时,10-40mg qd,注入膀胱。
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问
有什么药物可以诱导小鼠结肠癌从而得到结肠癌小鼠模型?
小布丁瑶瑶
诱变剂氧化偶氮甲烷(AOM)和致炎剂葡聚糖硫酸钠(DSS)可以得到
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问
结肠癌小鼠模型如何制备?
lzy必有我师
1)小鼠皮下移植瘤模型的建立(2. 1)将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡2min,取出组织,反复用 生理盐水冲洗三分钟,冲洗后标本组织无血液,将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径1. 5mm 大小,放在无菌培养皿中;(2. 2)用20号套管针把剪好的肿瘤组织分别移植到裸小鼠及BNX小鼠右侧背部近 腋部皮下,压迫伤口,无出血。每次套管针在电热真空灭菌器中灭菌; (2. 3)将小鼠放入小鼠IVC
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问
破膜固定处理后的细胞还能上流式细胞仪进行细胞分选吗?死活染料能区分在破膜固定前的死活细胞吗?
小小袋袋
细胞分选和破膜固定理论上不冲突,我觉得死活染料可以区分,但需要注意荧光是否会影响后续实验
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问
流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙?
崔果儿
加氯化钙的目的应该是使细胞内钙达到饱和
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问
求助!药物诱导细胞凋亡的实验,请求解答
小小袋袋
Q2+ Q4就是所有凋亡的细胞率,spss后续可以对组间进行t检验或者秩和分析,一次不够,我觉得最少三次
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问
请问ELISA实验,可以不进行预实验么?
师医生说
如果之前没有进行过,酶免法的酶联免疫吸附实验是需要进行预实验的,要进行环境温度,水浴箱温度以及使用的微量加样器进行评估,同样也要对使用的洗板机进行进一步的基板看下是否有其他的污染源存在,在保证实验中,人员,仪器,物料,环境各个环节完好无损的情况进一步使用以上的人血清实验
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问
关于细胞冻存 DMSO 浓度
生物技术学生
冻存时细胞浓度是关键,要是细胞浓度过低,因为冻存后会有很多细胞死掉,所以要多一些细胞复苏时容易长起来,我们也样 G2 和 60,我们用的是纯血清或者完培加终浓度为 10% 的 DMSO 后,直接放到 - 80 冰箱里都可以复苏我的完陪 + 20%FBS+10%DMSO, 存活率和绝对活细胞量都很低,有的全死。冻存的细胞量和浓度都很大的
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问
K48、K63泛素蛋白质粒表达出来的泛素有何不同?
lzy必有我师
K48就是一般设计目标蛋白的降解,连接仍然是细胞通过蛋白水解降解维持体内平衡的关键途径最远端的泛素第48位赖氨酸被精氨酸取代,限制链长。 K63连接的多泛素化修饰蛋白质已经涉及DNA损伤反应的调节,内体分选,蛋白质错误折叠/聚集的自噬等细胞过程和神经退行性病变。这些四泛素链是由野生型泛素的酶促连接产生的。最远端的泛素含有精氨酸取代赖氨酸第63位,限制链长K63一般涉及翻译后修饰的功能获得或者失活。
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问
多肽浓度会比蛋白浓度还要高的原因?
JCorona
原因:1.蛋白质具有三级结构,许多折叠、卷曲的部位往往无法被检测到,造成检测值偏低,酶解后许多被隐藏的信号释放到表面,检测值趋近于真实值;2.酶本身也是蛋白质,若是酶的添加量过多,则酶会催化自身水解,造成多肽量增多
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问
蛋白质质谱组学相关问题
医往情深丁香园
应该是不能用了,时间有点长,建议重新做一次吧,不然试试重新做也行。
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问
IB条带模糊/无条带的原因?
lzy必有我师
:1.确定B的抗体是否适合做IP。 2.确定样本中B的含量是否太低。3.还有就是AB之间不存在互作。
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问
目的蛋白和内参的条带形状反方向弯曲的原因?
lzy必有我师
如果蛋白样品足够的话还是建议跑两块胶,分别看内参和蛋白;如果一定要在同一张膜上面看的话,可以先看目标蛋白的表达,再用stripping buffer孵育去除一抗,再重新封闭,按照一样的步骤看内参,但这种方法比较不好掌控,stripping不到位,原本的抗体会有残留,stripping过度的话,再看内参的信号会很差
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问
WB内参跑不齐的原因是什么?
隔壁家的小夜猫子
细胞收的时候量不一样,测浓度,重新normalize
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问
目的抗体杂带太多,背景杂乱怎么办?
verbalkint
抗体不好,要么做ip检测,要么直接用标签抗体(gfp)不要用蛋白自己的抗体
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问
WB转膜10KD的蛋白电转条件?
医往情深丁香园
我们湿转时转膜液中一般都是不加SDS的,而甲醇是必须加的,量通常在100-200ml,我们在做12KDa时甲醇150ml,条带ok,转膜液中改加甲醇试试吧。
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问
细胞蛋白做WB无趋势的原因?
隔壁家的小夜猫子
点太多了,你想看趋势的时候尽量少点,可以摸索几次,点少了之后内参也可能能更清楚地看出并不齐,可能需要重新normalize
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