实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问硫磺素S染色的具体步骤是怎样的呢？

dxy_gwrp7ndq

1．石蜡切片，通过二甲苯和酒精脱蜡至水。2．切片放入0.25％高猛酸溶液中漂染20 minutes 。3.蒸馏水稍洗。4．切片放入白液中漂洗2 minutes 。5．蒸馏水稍洗。6．切片放入封闭液中漂染20 minutes 。7．蒸馏水稍洗。8．切片放入0.25％醋酸液中漂洗5 seconds .9．蒸馏水稍洗。10.将切片裱于载玻片上凉干、玻片保持平放。11．玻片用蒸馏水稍洗。12．滴上硫黄素

1 回答3382 围观

问请问明明BCA定量完了，为什么每次跑出来的GAPDH都不齐呢？还有其他蛋白归一化的方法吗？

今天摆烂了咩

可能因为BCA测定的是组织内总蛋白的量，组织内细胞类型较多的话，测定的某一特定蛋白的浓度会不准确，可以根据各条带的灰度调整下上样量，即调下内参试试。蛋白浓度测定除了BCA法外还有紫外吸收法，双缩脲法，考马斯亮蓝法等等。

3 回答1868 围观

问怎么设计实验用CO-IP（CO-Immunoprecipitation）验证两个蛋白是否互作呢？

txs900416

最基本的方法是用ip级别的抗体钓取一个蛋白，跑wb检测是否钓取的蛋白中是否有另外一个蛋白的存在。如果没有ip级别的抗体，则需要在细胞系中共表达两个蛋白，使得其中一个带tag（例如his，ha，flag等），使用抗tag的抗体钓蛋白，检测另一个蛋白，从而验证蛋白是否互作

2 回答694 围观

问跑wb的时候经常会出现多条条带，但这些条带的分子量不在对应的位置上是怎么回事呢？

府宅

SDS-PAGE鉴定表达的外原蛋白,分子量和Marker有一定的出入,一般在10kD左右浮动还是可以接受的,也许就是你所遇到的这种情况.不过最终的结果还是要看你的WB结果了;也许有可能是你的蛋白表达过程中提前终止,那就没有办法,只有更换载体

3 回答805 围观

问请问用脂肪肝样品跑wb如何把脂肪清理的干净一些？目前跑出来的感觉样品不纯

小布丁瑶瑶

1.尽可能的削掉不需要的脂肪组织2.调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片3.保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度

3 回答608 围观

问买回来的抗体敷育出来的条带为什么会出现跟案例完全不同呢？

dxy_gwrp7ndq

可能是转膜就没转好，或者没洗干净或者没封闭好。而且同一条带曝光多几次结果都可能有差异啦，更何况分开两次跑，影响因素很多的。

1 回答323 围观

问请问免疫细胞和肿瘤细胞共培养怎么操作

dxy_gwrp7ndq

因为淋巴细胞是悬浮生长，而肿瘤细胞一般要贴壁生长，所以可以采用简单的混合共培养的方法；如果是要有效的刺激淋巴细胞，选用合适的DC细胞也很关键；如果是要检测细胞因子的作用，也可采用共培养的方法；总之，目的不同，方法也不尽相同可以尝试这样一个方法,目的是看人外周血细胞是否被肿瘤细胞所刺激：肿瘤细胞贴壁培养，3000拉德照射或丝裂霉素处理使得细胞不再增殖，但仍保持存活，提取人外周血单个核细胞，与肿瘤细胞

3 回答8897 围观

问请问在在western blot过程中的高温变性是必须的吗？什么情况需要变性？什么情况不需要变性？如何避免磷酸化蛋白的降解？

府宅

不一定。要低温操作：室温条件下，磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融，操作时一定置于冰上。加入抑制剂：组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化，因此，必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。

3 回答660 围观

问如何选择合适的诱导剂并设计诱发炎症反应的梯度实验？

府宅

用实验来测定诱导时间比较容易，培养多瓶菌液（起始浓度要一样且要非常小，要来自同一菌株，最好先挑菌富集，然后平均分装到至少每瓶35mL的培养液里），放到摇床上摇，每隔一段时间去测OD600值，画生长曲线，看图画到指数中期时候就可以诱导了。若时间确定，那么可以设置诱导剂浓度为梯度0.1-1.0去测试哪一个浓度是最适的。设置方法和时间是一样的，注意哪些浓度等的变量要一样。温度就设置温度梯度喽，诱导剂浓度

1 回答451 围观

问求CHIP实验的详细步骤？

府宅

1) 将细胞或组织进行固定（交联）与裂解该步骤是在新鲜组织或活细胞中加入甲醛（终浓度1%），目的是稳定蛋白与DNA天然结合的状态，以免后续的实验步骤破坏这种相互作用。在固定完成后，细胞或组织进行充分裂解。固定时间一般为5-10 min，太长的固定时间将不利于后续的染色质片段化。强相互作用，如目的蛋白是组蛋白，固定时间应短一些：3-5 min。弱相互作用，尤其是间接相互作用蛋白，可适当延长固定时间，

2 回答627 围观

问组织免疫荧光片子图片杂质比较多，有解吗？

府宅

有些荧光杂点可能是非特异，建议检查一下封闭用的血清或者BSA是否有问题。如果确信荧光杂点不是生物信号，可以利用photoshop，通过调节色阶、通道相减、调节明暗对比度等去掉，但前提是确保足够的信噪比。如果找不到原因的话，还可以尝试将Caspase-3用红色标记，将NEnU用绿色标记，可能会有意想不到的结果。

3 回答955 围观

问复孔之间的误差可以有多大？想同时做两块板，板1做了标曲，板2可以省掉不做，以板1上的标曲为准吗？

府宅

复孔直接的OD值差别一般应在0.1－0.15。这两板在标准曲线方面的表现是一致的，其他检测步骤对标准曲线的绘制没有影响，如果这样的话，就可以用一个

2 回答406 围观

问请问western显影的时候条带偏离目标分子量较远，但是只有一个条带是什么原因？如何判断是不是目的蛋白？

府宅

有一下原因造成偏离。可以进行免疫肽封闭实验确定是否是目的蛋白。

2 回答188 围观

问请问在做western blot,IF,IHC等实验中，二抗可以用鼠二抗吗？

府宅

可以使用鼠二抗，疫学试验中常通过封闭试剂来封闭未吸附蛋白的固相载体部位，以减少非特异性结合背景的影响。如WB 试验中常用5% 脱脂奶粉或者BSA 封闭膜上除转印蛋白占据的其它部位。除了用于封闭未吸附蛋白的固相载体，封闭试剂也被广泛用于封闭其它非特异性结合。如IHC、IF 等试验中，特异性抗体与样本中Fc 受体的结合，以及在IHC 和IF 双染或三染实验中，驴血清也被广泛用于封闭试剂以减少抗体之间的

3 回答367 围观

问免疫组化实验中，常用哪些封闭液？

小布丁瑶瑶

一般的抗体封闭液是5%的脱脂奶粉或者1-10%血清，最好的是二抗来源动物的血清。

3 回答3201 围观

问免疫组化中，什么时候采用柠檬酸修复，什么时候采用EDTA修复？

dxy_gwrp7ndq

高温高压pH6.0柠檬酸盐缓冲液修复，适用于绝大多数抗原。需要用95℃热水浴EDTA（pH9.0）修复20分钟。适合于：CD10、CD138、Bcl-6、MuM1、VEGF、CD31、CD117、CD30、Cyclin D1、TdT、ALK。用柠檬酸修复后，切片需浸泡在修复液中，自然冷却；而用 EDTA 修复后，切片可直接从修复缸中取出，直接进行下一步。用EDTA修复比柠檬酸容易脱片。

1 回答2940 围观

问免疫切片越薄越好吗？

小布丁瑶瑶

冷冻切片并不是越薄越好，普通组织厚度约6微米即可，过薄，则易造成组织皱缩和镜下细胞核的碎裂。但是淋巴组织由于细胞间质少，切片可达4-5，脂肪组织要8-9方可观察到完整的脂肪细胞。组织结构单一的可薄切，含脂肪多的，结构复杂及硬度较大的可适当厚切。总之，以切出完整，平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱褶，保证组织结构的完整及切片的美观。

3 回答840 围观

问请问，雌雄C57老鼠做在体实验差异会很大嘛？有哪些疾病模型使用雄性C57，那些模型选用雌性C57呢？

txs900416

雌雄会有一定差异，例如，ConA注射的雌鼠肝损伤比雄鼠要重；eae在雌鼠中发病较高和严重，雄鼠则不敏感；器官移植中一般使用雄性c57做受体，因为好补液

1 回答1204 围观

问取器官标本前一定要放血吗？

txs900416

这取决于取标本的目的。例如标本需要提取损伤敏感的蛋白（DAMP）之类，放血可能造成damp的释放增加，此时不应放血，应迅速将样本置于液氮；又例如样本要包埋切片进行染免疫荧光等染色，此时红细胞的染色背景可能会影响实验结果，最好是放血。

3 回答365 围观

问怎么避免抗癌药物对自身造成伤害？

府宅

严格控制抗癌药的用量，可以预防性使用保护性药物，如护肝、护肾的药物

3 回答371 围观

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