实验问答

21,779,963 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

全部

细胞

问DTT特性在蛋白纯化和保存中有什么作用？

bamboopiggy

Cys存在于多种蛋白中，且其中的-SH常作为活性中心发挥作用，或者，两个-SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。-SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。所以，在蛋白纯化和保存时，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白-SH被氧化而失活

3 回答2403 围观

问用于纯化的亲和层析填料形式有哪些？他们各自的优缺点是什么？

dxy_gwrp7ndq

分类及其优缺点：生物亲和层析生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的选择性。典型的物质对有酶﹣底物、酶﹣抑制剂、激素﹣受体等。免疫亲和层析利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另一方的分离系统，称免疫亲和层析。免疫亲和层析应用相当广泛。此种方法的纯化蛋白倍数活性回收率非常高。用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品。免疫

3 回答1680 围观

问Rt 的引物Oligo dt、随机引物、基因特异性引物，这三种有什么区别呢？哪种比较好呢？

bamboopiggy

一般情况下。反转录的kit里面带的引物就是oligo dt和随机引物的混合物，直接用就可以，除非你是想从其中调出你的特异性基因，然后得到cdna，做过表达，否则。不需要用特异性引物，否则翻转效率会很低。

3 回答2930 围观

问目标蛋白设三个孔，目标蛋白跑的都不齐，内参是齐的

未来9

可能是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶。处理办法：配胶时一定要充分混匀，待其充分凝固后再做后续试验

5 回答411 围观

问电泳实验怎么分析条带?

whilt-shirt

主要是用Image J分析灰度值，将目的条带与内参的灰度值相比，就可以得到你目的蛋白的相对表达量

5 回答988 围观

问做wb实验每次只加一种一抗，可以同时加两种或者多种一抗的吗？

邓豆豆逗

理论上可以的，但需要把握好每种抗体的稀释比，否则很容易因为某个抗体效果太好或者某个蛋白表达量很高而只能看到一个条带，而且抗体尽量选单抗，不然杂带太多也会影响其他抗体效果

8 回答2808 围观

问如果没有注明可以用来做Western blot的一抗，可以用于Western blot实验吗？

邓豆豆逗

可以尝试做一下，如果做出来条带位置正确的话就是可以用于wb，一般抗体官网标明的适用实验是他自己验证过的，其他没写的不是说不能用，而是他没有验证，望采纳

7 回答603 围观

问在实验中无蛋白质的区域具有高背景是什么原因？要从哪些方面改进？

迟C迟

高背景可能是因为封闭不好：蛋白质转印到PVDF 膜或 NC 膜后，泳道与泳道间的空隙没有蛋白质；这时我们需要藉由额外的蛋白质缓冲液来填补其空白处。由于抗体本身也是一种蛋白质，因此若封闭作用不足，抗体可能会填进空白处的位置，进而造成高背景的结果。解决方案： a.封闭作用不足：这是其中一种可能的原因，提高封闭物浓度可确保封闭液完全复盖转印膜，如使用5% 脱脂奶粉或BSA。 b.封闭液是否会与抗体反应：

3 回答400 围观

问如何通过DNAstar测序已知序列

迟C迟

DNAstar软件共有七个小程序，MegAlign则主要执行序列比对的功能。开启MegAlign软件首先需要点击File---New 新建一个工作文件，再点击File---Entersequeces 添加需要比对的序列，支持多种格式的文件（.seq;.abi;.pro;.fas等），点Ａdd可添加多个文件，点Done导入选中的文件。点Align选择序列比对的算法，其中多序列比对有三种算法：The

3 回答759 围观

问如何才能跑满意的蛋白条带？求解决方法

迟C迟

WB实验要做的好，有以下几点需要注意：1. 样品质量。所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。2. 凝胶质量。不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个

3 回答568 围观

问磷酸化蛋白背景深，且无条带

闭门羹牛

确保完全裂解并使用新鲜样本；在做磷酸化蛋白的整个实验过程中都要保证低温环境。磷酸化蛋白在室温条件下很容易被蛋bai磷酸酶降解，即便加入磷酸酶抑制剂也很明显。所以务必要保持低温环境！

4 回答354 围观

问请问，如何控制蛋白条带的灰度呢？

dxy_iel2g9hw

一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件

4 回答183 围观

问想用一个短肽（5肽）做配基亲和纯化一个可以无他特异性结合的蛋白，用什么做调料比较好？

丁香粉猪猪

可以加点甘油或者乙二醇降低极性，还可以加2%的peg

3 回答417 围观

问如何通过数据库查找RNA的结合蛋白

迟C迟

RBPDB（http://rbpdb.ccbr.utoronto.ca/）是RNA结合实验的数据库，包括人、小鼠、蝇和蠕虫4类物种，总共包含272个RBPs的结合数据，包括71个具有位置权重矩阵格式的基序的结合数据，以及36组免疫沉淀实验获得的体内结合转录本序列。

3 回答495 围观

问RNA逆转录应该在哪个区？

闭门羹牛

在扩增区，同时避免发生交叉污染

3 回答621 围观

问RNA干扰后，荧光强度可以直接表征转染效率吗

迟C迟

3 回答585 围观

问RNA干扰技术有什么缺点

上海欧易

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型，是进行分子机制实验中最常用的实验技术。目前，RNA干扰方式主要集中在两方面：化学合成的siRNAs和Vector-based shRNA。对于siRNA，其通常直接使用化学合成并转染细胞，缺点是稳定性较低，作用时间也较短；对于shRNA，其有

4 回答1690 围观

问如何进行RNA的定量?

上海欧易

RNA定量最常用的方法是紫外分光光度计法，原理是核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可计算出其中RNA或DNA的含量。将样品的吸光度乘以稀释倍数乘以40μgRNA / mL，基于公式可以进行目标样品的浓度的计算。当然，目前市面上的一些基于分光光度计法的核酸定量仪器（如Nanodrop）已经不需要我们自行基于

4 回答1730 围观

问请问Trizol法提取RNA需要注意些什么？

dxy_gwrp7ndq

1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) ：加800ul Trizol，样品裂解后加氯仿，分层，沉淀RNA前，加5-10ug RNase-free糖原，糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成，也不影响PCR反应。2. 匀浆后，加氯仿前，样品可在-70 ℃放置一个月以上：RNA沉淀可以保存在75%酒精中，2-8 ℃一个星

4 回答1226 围观

问RNAi 和PRISPR对比，哪个技术更好呢？

Kimser

个人认为后者更好一些。RNAi 是一种基因下调方法，但并不能完全去除基因的功能。而CRISPR是在引导 RNA 的指导下，与目的核酸片段进行靶向结合并进行切割。此外，尽管 RNAi 和 CRISPR 均存在脱靶问题，但由于CRISPR脱靶效率要远低于RNAi。

4 回答1866 围观

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

实验小助手

扫码领资料

反馈

TOP

打开小程序