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问
WB时怎么选择合适的内参蛋白呀
迟C迟
(1)根据样本的种属来源选择,如哺乳动物或者植物等(2)考虑目的蛋白的分子量大小,一般需要与目的蛋白的分子量相差5kd以上(3)根据蛋白表达位置选择不同的内参,不同的细胞器中选择的内参也不同
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问
跑WB时,各通道上样蛋白是浓度相同还是质量相同?
府宅
将蛋白浓度高的样品稀释到最低浓度的样品,这样他们的浓度就相同了,上等样体积的量就含相等的总蛋白,等体积上样
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问
做wb的时候内参条带不齐,
未来9
单独上样可以出现,可以排除蛋白本身的问题,但混合一起加时却跑的不齐,最大的可能就是胶的问题,胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。再就是抗体孵育问题,不知你是用孵育盒,还是用封膜孵育,一定要保证膜与抗体充分接触,保证孵育效果。三是显影剂是预混还是混合好的,注意混合比例
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问
干燥RNA的时候是要干燥到什么程度最好?需要保持湿润吗?
迟C迟
最后的到RNA的上一步是酒精洗涤,提取的RNA当然不是完全干燥,提取后可以用小号枪头洗出较多的液体,剩下就在空气中自然干燥;但是太干就不容易溶解,因为太干的话RNA之间就结合的非常紧密。
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问
取材的时候没有液氮用干冰代替可以吗?
迟C迟
可以的,只要能冻住。很多生物公司运送样品也是用干冰,但是干冰的效果没有液氮好。
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问
如何有效控制内源酶的活性呢?
迟C迟
方法有很多。比如如果是提取RNA,可以通过低温。如果是提蛋白,可以加入蛋白酶抑制剂等等,这些实验步骤都很成熟了。
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问
枪头必须使用无酶的枪头,若只有普通枪头怎么处理呢?
迟C迟
要用DEPC水泡2天,再报上报纸,高压灭菌,就可以用作RNA实验了。
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问
WB结果中,目的条带后面为什么有细细的条带?
未来9
可能是样品溶解不好,或存在一定程度的蛋白降解
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问
WB实验条带异常问题?
vae1476
这种一般是胶不均匀的问题,等下层凝住了再加上层,会好一些
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问
包涵体沉淀(σ32)的溶解、重折叠和离子交换层析实验时
迟C迟
每 4 h取 150 ul 样品,用反相高效液相层析 (HPLC) 测定去垢剂含量,这样可以确定透析去除 SKL 需要多长时间和加到离子交换柱的样品中有多少去垢剂存在。
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问
蛋白质印迹免疫分析时,蛋白质如何转膜?
bamboopiggy
三明治夹心法,将滤纸 胶 膜 滤纸,制成三明治夹心的方式,然后分干转和湿转,看你的仪器。
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问
蛋白样品变性后能保存多久?多久后使用不影响?
未来9
-80,一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)
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问
表达标签蛋白的时候,蛋白标签放在哪段?
水木杰
如果没有信号肽的话,n端和c端同时做,综合表型来看,哪个做出来用哪个,都做出来首选c端。当然,这两个都不行的话,只有放中间了
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15897 围观
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问
关于膜蛋白SDS-PAGE电泳?
dxywode
先做个western确定下目标蛋白是否表达? 因为膜蛋白表达量教低,即使过量表达也只有1mg/l 甚至更低 SDS检测不到很正常。 保证每步都加PMSF或者相应蛋白酶抑制剂 避免被降解。换表面活性剂。不同膜蛋白适用的表面活性剂不同 参考文献的选择吧。不过没有参考的话 一般DDM是优先选择的。尤其对于a-helix膜蛋白。
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问
6.5%的EMSA 胶为什么100V跑一个半小时才能跑到1/2,理论上不应该半小时就跑到吗
dxy_gwrp7ndq
可能是电泳环境的问题,一般电泳大约50-60min,可以根据实际情况调整电泳时间及电压,而且电泳时间不宜过长
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问
coip实验中从免疫磁珠上洗脱相互作用的蛋白时,怎样才能只洗脱下来相互作用的蛋白,而不将磁珠上的抗体也洗脱下来?有专门的洗脱液吗
天一湖医者
可在洗脱之前加一步水洗,也可以有效降低洗涤液残留对磁珠洗脱效果的干扰。
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问
在做聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳时经常出现图中条带弯曲情况,影响文章质量,如果改变这种情况,怎么才可以让条带变直
生物小硕硕
可以在电泳加样之前空泳道电泳一会,使离子平衡
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问
wb跑胶出的条带为什么最上面还有条带?
dxywode
你可以尝试减少上样量,增大一抗稀释倍数。
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问
我要标泛素化和非泛素化的FANCD2,用5%的脱脂牛奶封闭标不出来,2X或者3XBSA可以标出非泛素化的,但是很脏,怎么改进条件
dxy_t7p3th22
封闭可以用5%的BSA,加大上样量和抗体浓度
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问
Co-IP实验对抗体有什么要求
未来9
抗体的选择十分重要, 选经过 IP 验证的抗体,可以减少假阳性概率。
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