实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问蛋白为什么要冻干？冻干对蛋白的影响有哪些？

bamboopiggy

冻干蛋白好保存，且不容易变性。冻干是物理干燥，不会影响蛋白功能。

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问曝出来的目的条带位置不对，预测位置在34，结果只有55有条带，而且很明显，为什么？

whilt-shirt

可能是杂带，建议更换新的抗体试试

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问去年在学校做的，好几次都没有结果，而且还很脏。

dxy_gwrp7ndq

二抗孵育的时间不宜过长，一般是室温下摇床孵育1~2小时，抗体孵育完成后要清洗干净，特别是二抗孵育完成后，否则可能导致显影结果出现高背景。

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问qPCR实验中Ct值是什么意思？有什么作用？怎么看？

天一湖医者

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不

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问IP后WB鉴定到目的蛋白，为什么质谱未鉴定到

天一湖医者

一般复杂样本中蛋白种类非常多，质谱检测并不能将所有蛋白质全部鉴定到，有些丰度含量较低的蛋白在质谱结果中不一定能够完整体现；Elisa/WB相比与质谱来说灵敏度不同，前者具有放大效应，抗体会对目标蛋白有一个富集效应，所以只要选对抗体，感兴趣的蛋白基本都会被检测到；而质谱结果中，如果目标蛋白丰度较低，在组学中未检测到也是正常的，质谱检测的后期验证建议用PRM。

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问选了β-tubulin做内参，老是有非特异条带，还整整齐齐的，有什么办法解决呢？

whilt-shirt

一般这种情况要不更换新的抗体，要不降低抗体浓度

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问跑western条带总是中间浅、两侧深的原因是什么？

whilt-shirt

是不是转膜没夹紧导致的，尝试更换新的转膜滤纸

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问wb中配置Running buffer和wet buffer时怎么选择SDS的浓度？

毛桃子啊

1.电泳缓冲液（Tris-Glycine/SDS）25mM Tris base190mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.32.转膜缓冲液（湿转）25mM Tris base 190mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH 值并将 pH 值调整至 8.3对于大于 80 kDa 的蛋白，建议 SDS 终浓度为 0.1%。3.转膜缓冲液（半干转）48mM Tris base39

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问Co-IP实验中使用的对照抗体有哪些？

天一湖医者

鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。

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问Single-nucleus RNA-seq没有线粒体基因了是吗？

万千490

1．线粒体由于含有自己的DNA等并能进行自我复制和转录、合成蛋白质而成为一套完整的核外遗传系统。 2．线粒体的结构物质，除部分可以自身合成外，同时又要依靠核DNA遗传系统的输入，是一种半独立性的细胞器。 3．真核细胞内所具有的两种遗传体系是处于互相影响、互相依存的复杂矛盾状态之中，核DNA遗传系统看来是居于主导地位

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问凝胶过滤层析过程中发现分辨率不高，可能原因是？

dxyv9281

加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。

3 回答618 围观

问如何确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是细胞的溶解

bamboopiggy

采用免疫荧光共定位相互作用的蛋白，看荧光的位置。

3 回答340 围观

问大分子蛋白总转不出来，该如何调节电泳条件?

dxy_a3w222q8

大蛋白先试试marker能转上吗，如果能应该没问题，如果不能适当在此基础上延长转膜时间；蛋白的上样量也可以加大吧，可以试试。

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问双向凝胶电泳为什么能一次性分离上千种蛋白质？

bamboopiggy

因为双向电泳一个方向分辨出不同分子量的蛋白,另外一个方向是同样分子量的蛋白，有不同的电荷，按照电荷的多少，再将同样分子量的蛋白细分，所以能从电荷和分子量两个方面来区分蛋白。

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问CO-IP实验怎么区别是两种蛋白直接结合还是有其他蛋白辅助相互作用？

邓豆豆逗

Co-IP只能证明两种蛋白有相互作用，无法说明是直接还是简介的，如果想知道是直接还是间接的，可以做GST pull-down实验。

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问CO-IP实验如何确定蛋白相互作用是发生在细胞中的，而不是由于细胞破裂溶解释放蛋白产生了互作？

lyang556

细胞裂解时采用温和的裂解条件，应采用非离子变性剂（如：NP40），这样能够不破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。要想明确蛋白间的相互作用是细胞中发生还是细胞的溶解才发生需要进行蛋白质定位。

3 回答285 围观

问我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。什么原因怎么解决

lyang556

估计是你的蛋白失活了，应该注意下实验步骤，看看提取、纯化、酶切具体是哪一步操作不当导致的，搞清楚后重做试试！

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问蛋白结构探索，什么是蛋白

小布丁瑶瑶

蛋白质结构是指蛋白质分子的空间结构。作为一类重要的生物大分子，蛋白质主要由碳、氢、氧、氮、硫等化学元素组成。所有蛋白质都是由20种不同的L型α氨基酸连接形成的多聚体，在形成蛋白质后，这些氨基酸又被称为残基。蛋白质和多肽之间的界限并不是很清晰，有人基于发挥功能性作用的结构域所需的残基数认为，若残基数少于40，就称之为多肽或肽。要发挥生物学功能，蛋白质需要正确折叠为一个特定构型，主要是通过大量的非共价

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问如何选择凝胶，以及层析柱？

bqejjh123

层析柱的选择一般根据分离样品的种类而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的 25～100 倍；而除盐或除游离荧光素时，柱床体积约为样品体积的 4～10 倍。层析柱太短会影响分离效果，如太长会延长分离时间和过度稀释样品。层析柱的内径过细会发生「器壁效应」。层析柱的内径和高度有一定的比例，除盐柱应为 1:5～1:25，纯化蛋白质柱应为 1:20～1:100。

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问膜分离技术在蛋白质的分离纯化方面具有哪些优势和不足？

lyang556

优点1、能耗低。膜分离不涉及相变，对能量要求低，与蒸馏、结晶和蒸发相比有较大的差异。2、分离条件温和，对于热敏感物质的分离很重要。3、操作方便，结构紧凑、维修成本低、易于自动化。缺点1、膜面易发生污染，致使膜分离性能降低，故需采用与工艺相适应的膜面清洗方法。2、稳定性、耐药性、耐热性、耐溶剂能力有限，故使用范围有限。3、单独的膜分离技术功能有限，需与其他分离技术连用。

3 回答1537 围观

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