做wb的时候内参条带不齐，

单独上样可以出现，可以排除蛋白本身的问题，但混合一起加时却跑的不齐，最大的可能就是胶的问题，胶配的不均匀导致蛋白跑的不在同一水平。

再就是抗体孵育问题，不知你是用孵育盒，还是用封膜孵育，一定要保证膜与抗体充分接触，保证孵育效果。

三是显影剂是预混还是混合好的，注意混合比例

主要是通过内参调整上样量使内参齐

第一，应该确认每个样品表达GAPDH的量一样，虽然是持家基因，本人觉得不同细菌可能表达量不一样，造成信号强弱不一样。可以通过考马斯亮蓝染色来确定上样量的差异，调整上样量一样再检测GAPDH。
第二，内参跑不齐。一般是跑胶时电流或电压太大。还有可能是样品中参杂着盐离子等其他物质也会造成跑不齐。
第三，PAGE胶的制备也很关键。看到条带信号连在一起，一方面因为胶不好，样品扩散，另一方面蛋白表达量 高，曝光时间长。
第四，转膜的效率会不会是不一致的，一抗、二抗的接合GAPDH不好。都有可能。
第五，本人在发文章做WB的时候也是做过很多次，每次都是不一样的结果。因为WB中间的步骤太多，影响因素很多，但是还是可以控制一下的。
第六，做过多次WB还是不行，建议新鲜制备蛋白样品。

测蛋白浓度只是相对的，你可以试试根据内参条带的量，调整一下上样量，前提是你的内参可以用。否则建议换个内参试试。