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问
转膜的时候怎么判断有没有把目的蛋白转移到膜上?
未来9
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 红染色液对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋 白的残留情况。
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问
WB条带每次曝光的时候条带边缘都有黑色的一圈是什么原因?
dxy_gwrp7ndq
第一 建议用5%脱脂奶粉封闭,有条件的话封闭过夜,室温下至少封闭1小时。第二 你 一抗二抗 稀释液应该都用 含脱脂奶粉的来配,这样可以降低背景。第三 这种现象我也遇到过,很可能是你一抗或二抗刚刚稀释之后,没有混均匀,然后就把膜放下去了。有的时候局部浓度特别大的时候,会造成严重的非特异性结合。第四 洗膜不需要洗那么长时间的。一般洗3次,每次6~7分钟就可以了。敷完二抗之后洗3次,每次10分钟,
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问
在样本制备和加样的过程中,所有会影响蛋白上样量的可能因素有哪些?如何提高蛋白上样量?
未来9
1、影响因素:样品浓度,蛋白裂解是否完全2、可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的,建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,以增大上样孔体积,可以试1.5mm厚的胶。
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问
如何利用血小板提取液检测血小板EP3受体
bamboopiggy
买ep3受体的抗体,直接western blot检测呗,如果少,就用elisa检测。
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问
蛋白纯化有杂质怎么办?
bamboopiggy
可以在上柱前,多离心几次,去掉杂质,如果是杂带的话,就挂柱以后,多洗几次。
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问
求助:wb蛋白条带位置不对
bamboopiggy
你看一下cst说明书里,wb的条带在哪里,其实你只要跑过全膜,确定了你的位置,即使位置和预测的不一样,也是可以的,就是你的这个位置有点寸,咋感觉是你的lysis没有打开到一级结构,还是二聚体的感觉。因为40-50,70-100正好是二倍的感觉
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问
请问一下P3出现阴性一般什么情况下会出现?
bamboopiggy
你说的是阳性对照出现阴性?那别的呢?如果都是阴性,可能是抗体不好使了,或者是浓度不够。
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问
P65和它的磷酸化问题
bamboopiggy
total的蛋白和磷酸化的一个趋势,这个是很常见的,你可以和内参比,只要p65磷酸化了,就是说明起作用了。
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问
请问这块胶是什么问题啊,分离胶没凝好吗?
智明在寻找春娇的路上一去不复返
看marker的话整个胶应该没问题。可能是上样量比较多 用ripa稀释下看看?
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问
样品中有无机杂质影响蛋白含量测定,有什么办法能降低干扰?
bamboopiggy
蛋白质的测定方法有好多,如:凯氏定氮法,双缩脲法,folin-酚法,考马斯亮蓝法,等等,你可以找一种与你的无机杂质不反应的方法来测。
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问
提取鱼类肠道微生物,用来做16s测序,有哪些好的方法?
bamboopiggy
找一个靠谱的公司比什么都重要,尤其是做过鱼类16s的,否则什么样的bug都会给你弄出来。甚至会测不到。
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问
western blot 内参
Y_沙琪玛
可能你用的内参是多抗而不是单抗的原因
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问
小白第一次做免疫组化,该选哪种做法最稳妥啊,两步还是三步法?
dxy_gwrp7ndq
二步法是灵敏度比较高的方法,操作较三步法便捷
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问
杂同一个蛋白的兔抗和鼠抗为啥结果不同?
迟C迟
首先,兔抗血清通常含有高亲合力抗体,可以比鼠抗血清识别更多种类的表位。其次,兔单克隆抗体能够以识别许多在小鼠中不产生免疫的抗原。
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问
为什么marker分子跑不到15KD?
whilt-shirt
15KD的分子建议用12%的胶,10%的胶跑不了15Kd
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问
WB最后条带曝不出来以及背景颜色很黑
迟C迟
背景黑考虑1.减少蛋白的上样量2.缩短曝光时间3.如果是化学发光,请减少超敏液的使用
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问
蛋白纯化有杂带怎么办
dxy_qm66y5m7
如果是his标签的话,首先与填料结合时使用的buffer里可以加点咪唑这样可以减少特异性结合,其次洗脱的时候可以适当提高咪唑浓度,加强对杂蛋白洗脱,最后就是更换填料的类型。以上只是对his标签蛋白提纯的优化,希望有帮助。
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问
蛋白一直跑不出来,出来的位置也不太对
迟C迟
位置不对可能得原因有:1.胶浓度不对,不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差,可以调整浓度2.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度,延长孵育时间3)酶失活,建议直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物4)目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体,建议查询相关文献确定5)标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低,建议设置阳性对照比对结果,增加标本上样量
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问
阴性对照组没有染色,但是组织切片和阳性对照却呈弱阳性?
Y_沙琪玛
1.阴性对照在洗片过程中被污染。2.染色体浓度太高。3.染色剂清洗不彻底。
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问
蛋白质浓度测量不准时,如何保证western blot上样量?
whilt-shirt
先根据BCA结果上一次,再根据第一次实验结果通过校准内参来调节上样量
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