实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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细胞

问敷内参tubulin出现70kd左右的条带是为什么？

dxy_gwrp7ndq

可以用已报道的该蛋白有表达的细胞系做一个对照，最好是抗体说明书上用到的细胞系，这样就可以看看到底是你样品的问题，还是WB体系的问题。

6 回答1111 围观

问我在跑蛋白的时候，经常遇到泳道一个隔一个有印记，中间的泳道空空如也的情况，检查了转膜液电泳液都没有问题，是怎么回事？

bamboopiggy

主要有泳道的影，就不是液体的问题，大概率是你的蛋白坏掉了，建议用新鲜样品。

4 回答397 围观

问使用快速封闭的试剂，封闭时间过长会导致一抗孵不上去吗？

bamboopiggy

不会减少封闭时间，只是为了缩短你最实验的时间，封闭时间长了没问题。

7 回答3680 围观

问跑出来的胶如果能记得加样顺序，那还分正反吗？对转膜应该没有影响吧？

bqejjh123

封闭时使用封闭液，液体盖过膜就好，所以无所谓正反，基本没什么影响

5 回答402 围观

问制胶的时候上层浓缩胶制少了，下层多了，但是梳子插得进去，在跑的时候怎么设置参数？

bamboopiggy

可以适当降低电压，由原来的80吧，改为40-60v，跑的慢一些。让蛋白在浓缩胶和分离胶之间能压成一条线就可以。

2 回答1385 围观

问保存的蛋白质复性，一般使用多少度水浴？到什么程度是复性成功呢？

未来9

样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。

3 回答732 围观

问同样一起跑的条带两边跑的速度不一样是因为什么？

bamboopiggy

大概率是你胶灌的不匀，但是也可能是跑胶槽子里的金属丝坏了，导致电流不匀。

3 回答556 围观

问转膜液可以回收吗？能重复利用几次？剩下的能放置多久？

迟C迟

转膜液不需要现配现用,4°保存可以反复使用至少7次, 对WB的结果不起决定性作用. 现配现用,用完倒掉会造成严重的环境污染

6 回答2417 围观

问染色的标本的核周围有杂质？是什么地方有问题？

bamboopiggy

大概率是你的抗体坏了，看看需不需要重新配抗体，或者洗片子的时候，多洗一次。

2 回答282 围观

问封片的时候建议用甘油-明胶还是树胶？或者树脂？

bamboopiggy

都可以，现在有那种固体封片剂，更好用，不会污染机器。

3 回答1311 围观

问最终染色不均匀是孵育温度有变化吗？还是别的问题？

bamboopiggy

是你抗体加的不均匀，温度也会有影响，但是抗体的原因比较大。

2 回答274 围观

问0.3%H2O2-80%甲醇室温孵育这一步，是将两个试剂混合加入后孵育吗？

bamboopiggy

是，用甲醇配置H2O2，到0.3%，加入孵育。

2 回答287 围观

问分光光度测定抗体所使用的抗体的稀释倍数是多少？需要根据补体类型进行调整吗？

bamboopiggy

你用分光光度计测，相当于测蛋白浓度，这个就取决于你测的时候，抗体的浓度和你分光光度计的范围，把抗体稀释到你机器能读的范围内就可以。

2 回答345 围观

问在肉眼或者镜下观察空斑的时候，还是只计数两条边的吗？还是全部都要计数？

bamboopiggy

方框，按照规律，只记数其中相邻的两条边。

2 回答396 围观

问从胚胎中提取RNA时，应注意哪些原则？

迟C迟

1. Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。2. RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。

4 回答627 围观

问荧光素酶互补实验验证蛋白互作的载体图谱以及酶切位点

bamboopiggy

仅供参考，不知道你手里质粒的名称，只能猜测是这个俩个吧

2 回答422 围观

问SDS凝胶电泳的上样量大家一般用的多少啊？

未来9

一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）

4 回答5591 围观

问WB实验中条带没有间隔的原因？

bamboopiggy

感觉是你上样浓度太大了，试试降低浓度。还可以降低抗体的浓度。没有间隔。主要是因为发光太强了。

3 回答729 围观

问怎么通过氨基酸序列推测它在折叠后的空间结构域

bamboopiggy

网上有好多预测工具，你可以试试，尤其最近AI出现，更方便了。如alphafold2

3 回答378 围观

问细胞生物标记物检测的方法:WB法和流式细胞仪，单用一个就行?还是必须联合使用

listener0014

另外一个也看经费是否充足，如果不差钱，肯定是越全越好

4 回答503 围观

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