实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问WB时为什么跑出来的条带总是斜的

迟C迟

主要可能是电泳凝胶配制时未搅拌均匀，造成条带未能直线跑完，电泳凝胶中混入气泡，造成条带被挤压倾斜，也可能是样品和缓冲液有干扰，造成条带迁移率不统一，另外上样量过大，被其他泳道挤压也有可能。

4 回答3402 围观

问蛋白裂解到底多长时间就可以呢？

迟C迟

加RIPA裂解液，4℃摇床上裂解26h和14h即可。

5 回答2195 围观

问怎样确定最佳缓冲条件和浓度使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。

dxy_gwrp7ndq

可以进行预实验确定最佳缓冲条件和浓度使非特异性结合到羧酸酯化葡聚糖上的靶蛋白和配体蛋白最小化。

2 回答476 围观

问18%分离胶跑酶解蛋白，60mg/ml 上样量10ul，80V浓缩胶120v分离胶跑出条带呈Y型且拖尾严重，求解

dxy_gwrp7ndq

如果蛋白含二硫键的话，还原剂量不足，可能会导致蛋白在跑胶过程中的动态成键，也可能形成拖尾。"拖尾"现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的，克服的办法是在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液，加增溶辅助试剂。另一方法是降低凝胶浓度。

5 回答857 围观

问请问PI3K-AKT信号通路里的PDK1用WB检测的时候一般测总量，还是测其磷酸化啊？！

府宅

PI3K-AKT通路一般测AKT/PKB信号通路磷酸化蛋白，可以通过检测抗体芯片（PAB216）

5 回答623 围观

问快切酶的酶切时间和什么有关，快切酶可以过夜酶切吗？

府宅

一般内切酶的活性是: 1U = 1小时切1ug DNA. 一般大家都用过量, 10U左右. 时间上我一般是: < 1ug, 1小时; 2-5ug, 2小时. 基本适用所有情况.

5 回答7026 围观

问使用超声破碎还是钢珠会更适合？

dxy_gwrp7ndq

超声波破碎很强烈，适用于多数微生物的破碎，但有效能利用率低，破碎过程产生大量的热，且对冷却的要求相当苛刻，故不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。

5 回答1031 围观

问WB扫出来的图第一次有气泡，再扫一遍会有影响吗？

Lv花开花落

没影响，静置一会儿能用。就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。

4 回答628 围观

问在点样的时候先加样品还是先加显色剂？需要考虑反应起始时间相同的问题吗？

dxy_gwrp7ndq

当然是要先稀释样品，再加显色剂，否则一会造成显色剂的稀释，有误差，

3 回答172 围观

问请问一下，SDS-PAGE蛋白质电泳，最近跑出来的胶都是这样的，以前不会，更换了配胶的母液，Buffer，还是一样，有哪位大神知

Lv花开花落

胶的凝结不好，例如有花纹特别是浓度高的胶在冬天温度较低的情况下，在分离胶的下部有波浪样的花纹，凝胶不均匀。解决方法：加大TEMED和过硫酸胺的量，使其凝结速度加快。同时洗干净玻璃板，防止有残留的胶干结在玻璃板上。胶不凝，解决方法：温度较低时加大TEMED和过硫酸胺的量，过硫酸胺必须新鲜配制。如若还是不行重新配制一下缓冲溶液。胶易碎，例如浓度较高的胶在染色和脱色过程以及扫描过程中破裂。解决方法：首先

4 回答1491 围观

问一张膜曝光之后，用那种膜洗脱液效果比较好，洗多久合适？

府宅

TBS/T洗膜3次,每次5分钟。用滤纸去尽残液

5 回答259 围观

问为什么疏水性差异的两种蛋白在反相层析和疏水层析上，出峰位置相反呀？

Lv花开花落

1、一种是疏水性太强，这样的蛋白质有非常强的疏水相互作用，往往容易导致结合上疏水层析后难以被洗脱下来。需要极其剧烈的洗脱条件，可是剧烈的条件由容易造成蛋白变性。所以不适合采用疏水层析。2、另一种就是疏水性太弱，这样的蛋白质亲水性强，疏水性弱，往往加入一点盐后就容易发生盐析作用。难以稳定的存在于高盐的流动相中，也就不适合采用疏水层析。

1 回答535 围观

问WB各组间内参的条带差异较大，可能的原因是什么，如何避免。

府宅

WB最关键的还是转膜和敷抗体步骤，可能是您敷抗体的时候敷的不均匀。建议您在仔细的做几遍也可能是在显影液环节，简单来说就是您的膜没有淋干净，上面残留参差不齐的 T/TBS，T/TBS 能稀释显影液，目的条带本来表达量就少，某一个点残留的 T/TBS 稍微多一点就可能导致显影效果下降，所以建议在显影液反应前，尽量将膜上的洗膜液淋掉

5 回答427 围观

问对于文献中特异性抗体，用到的并不多，都是买文献用到的那个公司吗？

dxy_gwrp7ndq

6 回答279 围观

问同一胶连续三个孔做重复不一样

我也是锦鲤ye

湿度、温度，实验过程操作的人工误差

6 回答303 围观

问为什么跑胶时那个样品条带跑的很宽？有人说是胶不好也有说电泳液时间长了，不知道原因？

未来9

有三种可能的原因。1.电泳缓冲液用的次数过多，一般来说电泳缓冲液用过两次以后电泳的效果就会变差。2.电泳的浓缩胶和分离胶缓冲液的PH没有调好或浓度没有调好。浓缩胶和分离胶胶浓度的变化和PH的变化让电泳样品压缩在一起。一般情况下浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tri s—HCl， pH8.8)。3.提取的粗蛋白样品里面有杂质，细胞里面除了含有蛋白质还有核酸、多糖、纤维素等

5 回答486 围观

问如何更好地保存蛋白？

dxy_gwrp7ndq

纯化后的蛋白测浓度后，加入50%甘油，确认混匀后分装，液氮速冻，放入-20度或-80度保存，尤其适用于酶类。如即提即用的话，可将浓缩蛋白质储存在单一溶液（如PBS），置于聚丙烯管或干净的玻璃容器中，放在4°C冰箱保存。

5 回答5803 围观

问怎么根据氨基酸序列来推测它折叠后的结构域。

dxy_gwrp7ndq

3D- pssm、Swiss － model （同源建模）可以预测

5 回答429 围观

问293T细胞外转泛素老是表达不齐怎么办？

府宅

防止细胞污染细胞污染也是造成细胞死亡,转染效率低下的一大原因

5 回答242 围观

问请问SDS-PAGE蛋白质样品上样后在高压下快速跑完和低压下慢速跑区别大吗？哪个更好？

dxy_vx1y73j9

低压条件下，条带相对均匀，位置更准确；高压条件下，由于加样量与样品浓度的差异，有可能导致条带不是一字型，或者跑斜；具体以自己样品与实验为准，多实验对比，如果高压和低压一样，那肯定高压，省时间。

7 回答265 围观

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