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蛋白纯化问题,换了不同载体,不同感受态,都表达不出目的蛋白
Eason老歌迷
感觉还是你的质粒没有构建好,你可以查查文献,看大家表达这个目的蛋白都用什么载体。
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问
免疫荧光实验爬片上的细胞每次根本都不能洗5min,特别容易掉,可能每次洗到最后,细胞都没了
Dr_劉医生
我的经验可能原因是细胞密度过高,特别是贴壁细胞,一团一团的,并不是很好的平面化,需要用枪头加细胞悬液给弄平,有个之前找的方法供参考。建议用10μl的小枪头吸取细胞悬液,在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样,这么做相当于在缓慢加样的过程中,玻片上的细胞又完成了一次从外向内和从内向外的混匀过程,防止某一部位的细胞聚集。加样结束后,镜下观察细胞初步密度。如果细胞密度过大,可以将玻片上的细胞悬液
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问
为什么细胞免疫荧光只能看到核,胞浆或者整个细胞的形态为什么看不到?
bamboopiggy
你核是用dapi染的吧?那个好显。然后看你的目的蛋白的位置是什么,然后选的抗体要好用。
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问
请教下,我的rt-lamp 实验的荧光图为什么是这样,用等温扩增仪做的,第一张是荧光图,第二张是熔解曲线图,有什么办法可以解决啊
Eason老歌迷
你看看是不是溶液浓度太浓了,感觉有点像自蚀。
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问
测蛋白浓度时BCA标准品未稀释怎么办?
balalaLy
标曲是不影响的,但可以会影响你的蛋白浓度值的准确度,如果你的样品蛋白浓度很低,超出了标曲的范围,就会不准。
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问
ip实验
Eason老歌迷
野生型细胞和过表达细胞系做的IP实验下拉下来的蛋白也不一样,会有差异的,建议你看看文献作参考。
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问
求助大佬
Eason老歌迷
把细胞放入0.2%的PFA中,4°过夜,然后换成30%的蔗糖过夜(组织沉入瓶底即可)。放入OCT中包埋(需准备液氮瓶和包埋的小塑料盒)。切冰冻切片,-80°保存。取出切片,在室温中静置10min左右。切片放入0.2%的PFA中,冰上10min。用PBS+2mMMgCI2清洗,冰上10minX2次(500mlPBS+1ml 1M MgCl2)c将切片放入detergentrinse中,冰上10min
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问
预测转录因子
Eason老歌迷
可以用JASPAR,也可以先用meme比对多个同源基因的启动子,找出保守motif,再用这个motif通过tomtom比对到一些已经发表的数据库,就知道可能结合的转录因子了。
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问
cleaved-caspase1的western blot
balalaLy
cleaved-caspase1不好做,它的表达量低且容易降解,可以尝试做一个时间梯度
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问
大鼠鼻中隔在哪里
Eason老歌迷
两鼻孔中间就是鼻中隔啊。取材的话,就是可以先用剪刀将大鼠鼻部整个剪下来,然后从中间剪开,(有两个牙齿比较硬,有点难剪,要注意)。从中间剖开后,可以暴露整个鼻腔外侧壁,然后取鼻中隔即可。
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问
求助,荧光酶标仪检测ROS活性氧,空白对照的OD值反而更高是什么原因
Eason老歌迷
是不是酶标仪没有调好?你的目测结果与酶标仪读值是否对的上,也可能使酶标仪设定参数不合适。
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问
细胞加药处理,发现药物作用窗很窄,药物加4小时,发现细胞碎了,还有必要做机制吗
Eason老歌迷
没必要吧。首先药物作用窗很窄,而且药物加4小时,细胞就死了。你这样后面实验很难开展。
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问
20g小鼠卵巢组织切片该切成多厚的呢?
balalaLy
组织切片一般到6um以下就能够做出比较好的形态了,当然再薄一点也是可以的,只要你切得出来
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问
有大佬知道这是染了什么菌吗?
bamboopiggy
是真菌,不要在细胞间打开培养皿的盖子,拿出到外面hood里,加入84做无菌化处理
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问
请问有人做snu387过表达转染用潮霉素的吗?急求一个药筛浓度参考,谢谢各位大神
bamboopiggy
我们的常用浓度是:hygromycin终浓度为80-160微克每毫升,你可以先加一个80,一个160试试,哪个死的多,但是能剩下一部分细胞用哪个。
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问
HepG2细胞做cck8
bamboopiggy
可以考虑换用mtt试试,cck8如果你加的药物有强氧化性会和cck8 起反应的。
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问
求助!HepG2.2.15细胞怎么养
bamboopiggy
hepG2.2.15你按照普通细胞养就行,dmem高糖,10%的fbs,1%的双抗。就是血清选好点的。
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问
制备单抗进行电细胞融合的时候,缓冲液的选择很重要吗?细胞不成串怎么解决?
Dr_劉医生
首先肯定buffer很重要,不然细胞融合和密度都有问题,如果商购专用的buffer按protocol来基本没问题;不成串的原因之一也是缓冲液不对,还一个两组细胞的比例得合适,看具体实验1:1,1:2都有。制备单抗的方法可参考方法学部分2.4()Song G, Huang L, Huang Y, Liu W, Wang M, Hua X. Electrofusion preparation of a
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问
巨噬细胞炎症模型
Dr_劉医生
做过ASCVD内皮功能查过相关的资料,大部分都是直接购买的RAW 264.7巨噬细胞系,借楼上国内很多都是用LPS诱导;附上几篇中文参考文献可以去参考,刘文强,张懿玲,熊华,朱雪梅,孙永.基于LPS诱导RAW 264.7巨噬细胞炎症模型的榴莲壳多酚抗炎作用及其分子机制[J].食品与机械,2020,36(04):15-20+50.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2020.
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问
测组织匀浆中的ROS,空白对照的荧光甚至超过了实验组
balalaLy
以前我们课题组也用过这个牌子的,会出现这种情况,做多几次,确保不要出现实验过程操作上对细胞的影响
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