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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
ip后蛋白分子量变化了(和input不在同一水平线上)是什么原因呢?
土井挞克树
首先要排除你的IP条带不是IgG的重链和轻链,再者排除你的一抗或者二抗没有污染,一般我们用新配的抗体理论上说IP的条带要和Input的一样。
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问
请问跑出来IgG泳道有和IP组一样目的条带大小的条带,且不是轻链重链的大小处,是什么原因呢?背景也很干净,没有杂带
loveliufudan
如果在免疫共沉淀(Co-IP)实验中,使用的IgG抗体出现与目的蛋白一样大小的条带,可能存在以下几个原因:免疫共沉淀实验中IgG抗体的浓度过高:如果使用的IgG抗体的浓度过高,可能会导致其在样品中非特异性地结合,从而产生与目的蛋白一样大小的条带。共沉淀的非特异性蛋白质:在样品中可能存在一些非特异性的蛋白质,这些蛋白质可能会与IgG抗体非特异性地结合,从而产生与目的蛋白一样大小的条带。良性异克隆:有
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问
flag beads 拉出来的flag条带有严重的拖尾现象是为什么?怎么解决?
土井挞克树
拖尾考虑是有样品裂解的问题,建议用新鲜的样品,最好是现煮现跑,不要过夜
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问
我跑出来的Co-IP,为什么IgG有很浓的条带
土井挞克树
ig G条带很浓可能是抗体特异性差的原因,建议更换特异度高的抗体
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问
请问IP抗体与IF抗体有什么区别?想做IP实验,但是没有目的蛋白的IP抗体,查了所有的公司,只有IF或者wb抗体,那么可以用IF
土井挞克树
不可以互用的,IF是荧光实验的抗体,Ip实验一定要用IP抗体
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问
请问老师,在病理状态下有些蛋白的作用是低亲和力的或者是短时间的结合,请问如何提高低亲和力活着短时作用的蛋白呢?
土井挞克树
可以使用交联剂增加蛋白间的亲和力和结合力,保证互作的检测
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问
蛋白丰度比较低,除了加大细胞投入量还有其他方法改进吗?
土井挞克树
蛋白丰度较低,可能是细胞裂解的不够充分,这时候需要更换裂解液,如果裂解充分建议还是增加细胞含量
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问
瞬时互作蛋白怎么交联
土井挞克树
可以选择紫外线交联,或者化学交联法。蛋白质通过交联方法可以稳定或永久连接相互作用复合物中的成分,有助于鉴别这些瞬时接触。
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问
请问紫外交联和化学交联哪一种更好一点
loveliufudan
如果要保留蛋白质的原始结构和功能,可以优先考虑紫外交联;如果需要稳定固定样品中的相互作用,并且样品的结构和功能不受交联剂的影响,可以选择化学交联。
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问
交联剂的使用,是结合更容易和牢靠吗,感觉平时实验好像没用到
赛默飞世尔科技
交联剂主要是在相互作用较弱的蛋白互作检测中会用到,因为蛋白间相互作用较弱,很容易在样本制备过程中就破坏掉,所以这种情况下会推荐使用交联剂先固定住蛋白间的相互作用,以保证在后续CO-IP实验中被检测到。对于蛋白间相互作用比较强/稳定,在温和裂解液中不会破坏掉蛋白间的相互作用,这种情况就不需要用到交联剂。
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问
我想请问coip蛋白破碎离心后,浮在上层的白色物质会不会影响蛋白与珠子结合,有什么办法可以避免吸到白色物质吗?
土井挞克树
可以用吸管缓慢多次吸取掉白色物质,或者加pbs稀释,更容易清除一些
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问
免疫共沉淀-样品制备 哪些步骤是可以灵活调整的,比如哪一步可以暂停一下?
土井挞克树
一般建议尽快裂解,负八十度保存不要超过三个月,时间太长会造成蛋白降解
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问
裂解液成分中Triton x 100,NP-40,SDS,deoxycholate这几个哪些是CoIP比较适用的?为什么? 细
土井挞克树
我一般会选择Triton x 100,因为coip通常不需要那么强的裂解作用,其他几种容易裂解过度
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问
有适用于植物的IP裂解液产品吗
土井挞克树
可以选择植物RIPA裂解液,裂解效果比较强
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问
交联试剂盒里的细胞裂解液需要额外再加蛋白酶抑制剂么?
土井挞克树
一般是不需要的,裂解液中包含蛋白酶抑制剂,如果实验过程中蛋白降解太多,建议另外添加
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问
关于膜蛋白的Co-IP,有没有比较高效提取膜蛋白但是不破坏蛋白相互作用的裂解液呀
土井挞克树
这个可以考虑某些品牌新出的试剂盒,据说效果都不错,或者使用离心管柱法进行提取,能最大程度的保护蛋白性质不被破坏
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问
裂解液如何选择? 如何做泛素化的IP,条带怎么看
sswei
用于普通的Western、IP或co-IP,推荐使用Western及IP细胞裂解液,另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP,如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想,可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高,即非特异的蛋白也被IP下来,则需要选用裂解强度较高的裂解液,例如RIPA裂解液(强或中
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问
细胞裂解液用乙酰化抗体富集IP后,胶内酶解MS检测会不会丢失一些痕量修饰的蛋白
土井挞克树
又可能会少量丢失或降解,痕量修饰蛋白在酶解时可能有少量丢失
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问
老师用动物组织标本做COIP与细胞做COIP有什么区别?您更推荐哪个?
土井挞克树
胞内蛋白做coip一般选用细胞标本,胞外蛋白一般选择组织标本/
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问
蛋白电泳时设置了恒压但是变成恒流电压在不断下降其他人使用电泳仪是能设置恒压,我们不同的是电泳槽,而且电极缓冲液用了一次就发黄为啥。
loveliufudan
如果在进行蛋白电泳时设置了恒压,但实际上电压在不断下降,有可能是由于电泳槽和电极之间存在电阻或连接不良等问题导致的。此时,电流可能会持续增加,直至超过预设的电流限制,从而导致恒压模式自动转变为恒流模式。如果其他人使用电泳仪可以设置恒压,而您的电泳槽却不行,可能是由于电泳槽的设计、材质等方面存在问题。不同的电泳仪和电泳槽可能有不同的电流密度、电极距离等参数,需要根据实际情况和要求进行调整和优化。至于
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