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科研学霸天团，48小时有问必答

问蛋白质印迹细胞提取液问题？

dxy_gwrp7ndq

也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

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问SLE中Sm抗体为何检测率这么低？

dxy_gwrp7ndq

抗 Sm 抗体在 SLE 中特异性高,但敏感性低

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问大家都怎么防止蛋白降解啊？

whilt-shirt

1、在样品制备过程中添加蛋白酶抑制剂；2、样本用液氮保存，超低温下蛋白降解慢。

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问ACTIN为啥有两个条带？

DXY泡沫呀

有实验技术的原因，曝光的时候会有底片轻微移动的现象,出现很接近的两条

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问电泳的拍照后有阳性显示两条条带是什么原因？

dxy_gwrp7ndq

原因；样品分解，一抗特异性不好或者浓度太高，PVDF膜封闭不够彻底，抗体没有四度过夜，或者上样品太高等

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问为什么WB显影后，有些位置没有条带，但内参上样量一致，重新转染后仍是没有，请问这是为什么，有什么解决办法吗？

小郭医生go

我的跑了都是质粒空载转染的没有出现目的条带，可能本身表达量就很低，或者你加大上样量试试看

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问WB总是做不出理想的条带肿么破？

飞天幻雪

做不出理想的条带是什么意思呀？内参不齐？没有目的条带？杂带太多？还是做出的趋势和实验预期不符合？？

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问做WB有什么要注意的吗

66QB1H

1.选择合适的分离胶浓度2.选择合适的电压、电流3.选择合适的一抗和二抗，并注意一抗二抗浓度和孵育条件（时间、温度等）3.洗脱时注意时间，太长太短都有影响4.配胶和转膜过程都要防止气泡

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问出现蛋白没有活性什么原因？

dxyjonas

蛋白质在抽提时，许多试剂都会改变蛋白质的空间结构，如二太多键的断裂，些金属离子的析出，以及各种次级键的重新组合都会影响蛋白质的功能。

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问在跑wb时同一个蛋白在不同组织或细胞中显示出不同的条带，有的一条有的两条，出现这种情况的原因是什么？

whilt-shirt

有可能是抗体对不同组织的特异性导致的

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问蛋白质实验相互作用的优势

dxy_gwrp7ndq

蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。

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问为什么蛋白电泳时不需要加冰，而转膜时需要？

whilt-shirt

电泳时用恒压，一般先低压（60或80V）后高压（120或150V），这时候对应的电流不高，一般最高都不超过100mA，而转膜时一般用的恒流（300mA），高电流通过自然产热量就大了

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问为什么PCR测出来某基因表达高，但western测出来低表达

dxy_gwrp7ndq

1.所要检测的目的基因存在选择性剪切体，可以产生成熟的mRNA，但是不一定能翻译成蛋白质。2.做定量PCR的内参基因，最好与做western的内参基因保持一致. 3.注意转膜过程中蛋白质是否转移完全。

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问求教RTPCR非特异性信号多的原因及解决办法？

whilt-shirt

1、引物为非特异性引物，优化扩增条件，可设置梯度Tm，摸索最佳的Tm值；2、引物浓度太高，适当降低引物浓度；3、可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体；4、模板有基因组污染，重新逆转录cDNA

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问关于融合蛋白纯化的问题？

Amor良

1、操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。2、不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。3、合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。4、使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解;在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。5、避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。6、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。7、在缓

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问就目前而言，底物与肝细胞色素P-450结合光谱的测定技术，有没有什么注意

315 围观

问跑出来的蛋白条带每一个呈现波浪锯齿形可能是哪些原因导致的呢？

dxy_gwrp7ndq

1、胶要凝得均匀，装胶时漏得厉害就不行2、电压不能太大3、样品中的盐离子浓度高，需脱盐。4、电泳缓冲液，胶缓冲液的PH值要对，最好是新配的

3 回答3061 围观

问请问大家用什么稀释一抗和二抗呀，脱脂奶粉，TBS，TBST有什么区别？如果条带不好看，怎么判断是不是一抗的问题呢？

txs900416

一般用5%bsa-tbst或5%脱脂奶粉-tbst孵育，tbs和tbst的区别在于tbst中多了一个t，即吐温20，Tween 20 是非离子型去污剂。因为western中所用的膜可以与蛋白质结合，这样的话孵育过程中，抗体是能够与膜非特异性结合的，为了防止以后曝光造成胶片背景太高，在孵育抗体后，混有Tween 20的PBS 能够将非特异性结合的抗体洗掉，增加特异性。看一抗有没有问题建议使用阳性对照

2 回答6454 围观

问请问在wb实验中转膜后，发现所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决?

黎咖勒翟

转膜夹松动，下次多加一层滤纸。

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问跑wb的时候经常会出现多条条带，但这些条带的分子量不在对应的位置上是怎么回事呢？

府宅

SDS-PAGE鉴定表达的外原蛋白,分子量和Marker有一定的出入,一般在10kD左右浮动还是可以接受的,也许就是你所遇到的这种情况.不过最终的结果还是要看你的WB结果了;也许有可能是你的蛋白表达过程中提前终止,那就没有办法,只有更换载体

3 回答814 围观

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