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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
WB条带周围总是黑黑的一团,不知道怎么回事
未来9
可能的原因①膜封闭不够,建议延长封闭的时间;选择合适的封闭液。②一抗稀释度不适宜,太高,选择最适宜的抗体稀释度。③ 一抗孵育的温度偏高,建议4℃过夜孵育。④选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点。⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。⑥检测时曝光时间过长,可减少曝光时间。
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问
为什么WB条带一个位置总是有两条,只敷了一种蛋白?
whilt-shirt
可能是抗体的特异性不好,也有可能是抗体浓度过高
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问
跑出来的带总是弯弯曲曲的怎么处理?
bamboopiggy
灌胶匀一些,或者低电压跑慢点,或者用软件拉直。
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问
跑出来的带总是很弯曲是哪里出了问题?
whilt-shirt
配胶没混匀,或者电泳液有问题。
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问
请问,敷抗低温过夜和常温2h,效果差别大吗?
天一湖医者
差别很大的,建议低温过夜,常温2小时有有可能会不显!
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问
请问大分子目的蛋白,本底表达低,每次跑出来都只能看见maker,目的条带都很若,有什么解决的办法嘛?
迟C迟
推荐使用Tris-Acetate 凝胶跑大分子蛋白,会呈现更高的分辨率。凝胶浓度与孔径成反比,即凝胶浓度越小,孔越大,较大分子量的蛋白质更容易通过,所以建议使用6-8%浓度的分离胶,当然也可以使用梯度凝胶。
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问
植物总蛋白提取相关,请问怎么提取植物总蛋白效率高,如何能western时不反白
bamboopiggy
你wb反白,就是因为你蛋白浓度高了,最好降低上样浓度试试。因为蛋白浓度高,辣根过氧化物酶反应剧烈,在你来不及显影之前,就把发光底物消耗光了,反而不能发光了。
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问
WB条带白色背景黑色是什么原因?
dxy_yjs8h877
很多时候是因为封闭的不好,或者洗膜洗的不干净的原因导致的。
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问
跑蛋白胶的maker用多少合适呢?
dxy_yjs8h877
一般为了节省都用5ul左右就够了,怕不好点样的话可以适当稀释一下然后加大用量也可以。
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问
两块胶一起转膜,为什么一个成功一个失败?
天一湖医者
考虑到会不会是封闭时间不足或者膜有没有出现干了的现象。
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问
做WB的时候用商品化封闭液封闭结束是否需要用TBST洗脱后再加一抗孵育?用脱脂奶粉的时候是洗脱的,不知道这种成品是否仍需要?
vae1476
每个商品化封闭液都有自己的Protocol,所以要按照说明书来做,其优点是封闭时间很快。
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问
如何稀释已经加入5xloading的蛋白质,如果用1xloading的话,那怎么用那种试剂把5x稀释成1x的
银月Icarus
最好是使用配置loading buffer的溶剂,加入四倍体积就可以
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问
有木有人教学一下大分子量的蛋白应该如何操作呀?
未来9
250kd的蛋白不好做,分离胶用7%,积层胶 3.5%。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间,但必须控制温度,保证低温电泳和电转。
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问
求解:WB提取蛋白时,什么情况要加DTT?作用是什么?比例多少?
未来9
如果是本来就有正确结构的蛋白是不需要加DTT的,如果是变性的蛋白,并且其一级结构中含半胱氨酸,那么缓冲液中加DTT,并且逐渐减少DTT浓度。DTT是防止错误的二硫桥形成的,蛋白会先向正确结构形成二硫键,但是这个过程较为缓慢,如果直接不加还原剂,那么正确的和错误的二硫键都会形成。所以慢慢的降低DTT,使蛋白形成正确的结构而不至于形成错误的二硫键。如果4xloading buffer中不含有DTT就按
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问
WB实验做完了,所有条带颜色都很浅怎么回事呀?
fenfen1110
还有一种可能:是不夹板夹的不够严实,导致转膜不完整
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问
聚丙烯胺分离胶相关问题请教
whilt-shirt
6%胶50-150kD8%胶30-90kD10%胶20-80kD12%胶12-60kD15%胶10-40kD
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问
对蛋白质分离纯化时,如何能够取得纯度高和总回收率高的
Kimser
诱导时间最好提前做一下预实验,可以先试试25或者30℃附近,这样可以提高纯度和回收率
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问
如何有效捕捉蛋白印迹图片?
sunny陈520
有效捕捉是让蛋白最佳显色吗?我们实验室用的是荧光显色,所以直接显色就可以了,现在很多仪器是自动曝光,也会自动选择最佳曝光时间,如果是暗室的话,需要根据蛋白曝光程度,如果很容易曝光,几秒就可以了,如果很难显色,可能压片的时间要长一点
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问
蛋白印迹定量分析常用软件?
sunny陈520
ImageJ常用,也通用,也可以用仪器上的软件,看个人需求了
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问
跑WB时,各通道上样蛋白是浓度相同还是质量相同?
府宅
将蛋白浓度高的样品稀释到最低浓度的样品,这样他们的浓度就相同了,上等样体积的量就含相等的总蛋白,等体积上样
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