有关WB实验转膜失败的问题？
浪子在天涯
SDS-PAGE跑胶还可以，但是转膜转几次都有问题，小分子量的能转过去，大分子量过不去。转膜液配了好几次，转膜“三明治”顺序为没错，电极方向也不错，应该注意哪些方面？
4 个回答
天一湖医者
你的电转条件是湿转还是半干,如果是湿转,试试变换一下转膜条件,注意一下电转液中甲醇的量,因为它是用来洗脱蛋白上结合的SDS的,而SDS多了很可能就转不上膜.一般甲醇量在15%左右.另外PVDF膜要用甲醇浸透,并且平衡时间一定要够.
未来9
大分子量蛋白的转膜需要如何优化条件呢
1）适当降低凝胶浓度：大分子量蛋白可更加有效地从低浓度的凝胶中转移出来，但凝胶浓度过低容易被撕裂、不太好操作。可以考虑针对蛋白分子量选择6-8%的丙烯酰胺凝胶。
2）添加SDS：分子量较大的蛋白容易在凝胶中沉淀，在转膜缓冲液中添加不超过0.1％的SDS可以有效阻止其发生，同时SDS也会抑制蛋白与膜的结合，故其浓度不宜高、且需优化转膜条件以防止蛋白透过膜。
3）降低甲醇浓度：甲醇与SDS具有相反的作用，甲醇可以增加蛋白与膜的结合，它可从蛋白质中剥离SDS。降低转膜缓冲液中甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。一般我们可以将浓度降低至10％或更低。
4）考虑选择较低电压、较长时间、湿转的方式：湿转的效率更高，可以考虑较低电压下过夜转膜。
bqejjh123
可能的原因
(1) 膜没有完全均匀湿透
使用 100% methanol 浸透膜。
(2) 靶蛋白分子量小于 10 000
选择小孔径的膜，缩短转移时间。
(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值
可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。
(4) 甲醇浓度过高
过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。
- (5) 转移时间不够
bamboopiggy
看你大分子量那边的marker转过去没有？转大分子量的需要延长转膜时间。关键先看marker。
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