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科研学霸天团,48小时有问必答
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关于WB实验跑带问题?
天一湖医者
问题出在每一步都有一定的可能性,比如电泳,转膜,敷抗体,显色等等
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问
wb只在顶端有结果
balalaLy
有没有可能是抗体失效了,上面那个只是杂带
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问
蛋白筛选
Eason老歌迷
wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络。wnt配体可与卷曲蛋白相互作用,导致各种细胞内信号传导级联激活,这些信号传导级联又可以交叉连接或独立发挥作用,调节多种多样的生化过程。wnt3a是wnt/β-catenin经典途径中的主要配体。当存在wnt3a配体时,其会与细胞膜上的受体fzd结合激活wnt信号通路,导致β-catenin去磷酸化,使得β-catenin在细胞质中富集并转移至细胞核内,与t
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问
蛋白不是花就是拧,每次都是那个地方不好,请问是转膜的问题还是胶或者膜有问题呢
秋秋欣欣
每次都是这样的话估计是你的蛋白有问题了
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问
wb黑糊糊一片,是怎么回事呀?湿转,300mA 100min,分子量110kD左右。
秋秋欣欣
除了封闭外,发光液配置时间过长同样会引起发光效果不好,背景脏或者漆黑一片。
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问
磷酸化蛋白免疫印记实验
天雨心晴
时间长点,一般问题不大,主要是抗体的浓度和特异性可能存在问题。
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问
慢病毒包装完,其基因组是一条单链RNA吗?是慢病毒质粒上的5' LTR到3'LTR吗??
Eason老歌迷
包装好的病毒只含有结构质粒5'LTR和3'LTR之间的RNA序列。包装蛋白的RNA是不进入包装完成的病毒的。
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问
表达蛋白发现偶尔在上清偶尔在沉淀,这个问题怎么解决,这几次纯化的效果都不好?
朵儿小可爱
建议如果用镍柱来纯化蛋白的时候,纯化的过程纯化之后的溶液当中适当的加一点EDTA,让它螯合脱落下来的镍离子,减少重金属对蛋白的伤害
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问
请问有时候WB结果呈现以下这种条带,可能是什么原因呢?
朵儿小可爱
胶体中存在气泡,或不溶性杂质,胶不均不平整。
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问
如何确定蛋白是否正确折叠
Eason老歌迷
蛋白二硫键不正确折叠肯定会影响后续其与另一个蛋白的结合。即便是蛋白质氨基酸支架的微小改变,也会引发错误折叠并且妨碍蛋白质功能或引发疾病。我记得中科院有一个项目就是如何确定蛋白是否正确折叠,你可以查查看。
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问
邻联茴香胺甲醇溶液如何配置?可以用其他溶剂吗?
汤姆卜丽波
邻联茴香胺甲醇中甲醇的作用主要是溶剂和固定,配置一般是1%的浓度,1g邻联茴香胺100ml甲醇,工作浓度1:100加入磷酸盐缓冲液,现用现配
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问
WB两张膜,为什么差别这么大
天一湖医者
可能是操作过程中有问题(可能原因是(1)、你结合底物会不会有问题,即没有充分结合好,或者结合时间太短,(2)、你要确定两张膜都是用新的底物反应液,(3)、就是没有信号的膜会不会压片时间太短,如果使用仪器扫片就不存在这种问题,)所以原因比较多,你只能逐一排查。
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问
请问大佬们有没有遇到过质粒转入293t中表达,但目的细胞不表达的情况?
bamboopiggy
1.用慢病毒感染293T再是一下,如果还有表达那只能说明你的目的细胞对这套系统不合适。2.可能你的细胞本身对这个筛选的抗生素抵抗,所以你筛不到目的细胞,导致wb显不出来。
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问
有时候做完WB,发现非特异性条带很多(如图所示),请问可能是什么原因?怎么解决?
Eason老歌迷
你这个跑的是啥蛋白啊?我感觉是你的抗体特异性差,全是杂带
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问
转膜液的配方中加甲醇的作用是什么?
Eason老歌迷
有几个原因,一个是可以降低电导,减少转膜时候的发热。二甲醇可以使sds和蛋白分离。
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问
即使两次的上样量相同,但是内参却不一样,是为什么?上样过程都是一样的
bamboopiggy
其实你觉得你上的一样,还是有误差的,只要趋势一致,或者是比值差不多就可以了。当然还有一种情况就是蛋白降解了。
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问
蛋白质样品前处理的优化
Eason老歌迷
我们都是一次性煮好,金属浴100℃十分钟。然后用的时候拿出来,金属浴100℃三分钟。即可。
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问
WB结果中其它条带均正常,只有其中一个条带出现变形,请问这一般是由什么导致的呀?
dxy_x0eq0ed
是不是胶没配好,配胶刚好那一块不均匀,所以就变形了。
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问
SDS-PAGE出现异常条带,比如微笑现象,拖尾现象,文理现象,条带粗等是什么原因?怎样可以避免?
府宅
纹理现象:可能是由于样本中不溶性颗粒引起的。建议:加样前离心;加适量样品促溶剂。拖尾现象:主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。
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问
WB结果中可能出现有目标蛋白条带,但是目标条带在膜上颜色较浅,请问这是什么原因呀?
天一湖医者
转膜不充分 规范转膜的操作;优化电转条件;可将两张膜叠加在一起,防止转膜过度,或使用小孔径膜洗膜过度 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,减少洗膜次数,洗膜时间和温度封闭过度 减少封闭时间,试用不同的封闭液曝光时间过短 延长曝光时间,如使用化学发光成像系统,可调整显示灰度值抗体染色不充分 延长孵育时间或增加抗体浓度抗体问题 抗体浓度低 增加抗体浓度抗体和抗原亲和力不足 增加抗体浓度抗体活
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