实验问答21,857,592 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问请问RNA-seq技术的具体流程是怎样的？有哪些文献可以参考？

huarenqiang5

1. workflow进行差异表达基因分析的前提是，获取代表基因表达水平的矩阵。因此在进行分析前，必须知道基因表达矩阵是如何产生的。在本教程中，将会简要的介绍从原始测序读数到基因表达计数矩阵过程中，所采取的不同步骤。下图是整个分析过程的流程图。2. RNA提取与文库制备在对RNA 进行测序前，必须从细胞环境中提取和分离出RNA 制备成cDNA 文库。下面将介绍涉及的许多步骤，其中还包括了质量检查，

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问为什么我的qPCR结果内参和目的基因的ct值都很高？

huarenqiang5

考虑以下几点原因:1）模板量低或基因表达丰度低。2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当。 3）扩增产物过长。

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问扩增曲线异常-刚跑就有扩增并消失

高山云初

1.扩展失败,应调整反应条件和体系2.退火延伸阶段（60度，1min）存在部分链退火不充分；因此在信号刚开始采集阶段，部分链会继续退火形成双链，荧光信号增强，退火充分后荧光信号达到最大值，此后随着温度的上升，pH降低，导致荧光信号强度降低，反映就是出现沟了3.意味着扩增产物不再是目标序列，而是非特异性扩增了

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问想问一下，各位前辈，对照组和实验组是两种不同的细胞，但是他们复苏的时间不一样，这样做出来的结果可靠吗？

sswei

对照组和实验组是两种不同的细胞，但是他们复苏的时间不一样，这样做出来的结果不可靠

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问关于PCR的CT值问题咨询

sswei

CT值为小于35，处于正常值，可使用的。

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问请问一下做单B细胞技术的大佬，我做巢式pcr看文献是p出抗体可变区，恒定区去掉，为什么不能连恒定区一起p呢？求解答🙏🙏

土井挞克树

恒定区不需要做pcr，后续直接结合抗体就可以

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问请问有做单细胞PCR的大佬吗？我逆转录为cDNA后，设计引物PCR抗体重轻链，但P不出来，拖尾弥散

土井挞克树

考虑是样品内存在降解所以才会拖尾这么严重

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问Hprt1的ct值大约多少啊？

huarenqiang5

hprt1的ct值一般在20左右都可以。

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问做SNP的统计分析流程是什么？

小小翻车鱼

以下是进行SNP统计分析的一般流程：1. 数据准备：首先需要收集SNP芯片或者测序数据，并整理为可读取的格式。同时，需要收集表型数据，如病例与对照的临床信息等。2. 数据质控：在分析之前需要进行数据质控，包括SNP和样本质量控制。对于SNP数据，可以检查基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡，以及缺失数据和错误基因型的比例是否过高等。对于样本数据，可以检查样本是否存在批次效应和离群值等

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问H9C2细胞的 Myh7、ANP、DKK2基因RT PCR的引物序列？

周末也要努力呀

1. Myh7（肌球蛋白重链7）： - 前向引物：5'-ATGAGCGAGGAGGAGGAGGA-3' - 反向引物：5'-TTAGAGGTCAGTGGTGGTG-3'2. ANP（心房钠尿肽）： - 前向引物：5'-ATGGCTGCTCTCTGCTCTG-3' - 反向引物：5'-TTAGAGGTCAGTGGTGGTG-3'3. DKK2（Dickkopf 2）： - 前向引

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问基因组 DNA 进行 PCR 之后电泳结果条带宽

周末也要努力呀

跑胶的时候没有压好，跑慢一点。

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问H9C2细胞的Myh7,Anp,Dkk2引物为什么p不出来呢

土井挞克树

考虑是cdna的纯度不够，建议选用纯度高的cdna

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问请问动物实验pcr需要重复三次吗

科研闪现

需要的，三次最好的，每个样品至少有三个重复

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问qPCR实验内参的值都比目的基因的值大，这正常吗。

龙大人驾到

在 qPCR 实验中，内参基因（也称为参考基因或稳定表达基因）应该具有相对稳定的表达水平，不受实验条件或处理的影响。它们通常用作标准化因子，用于对目的基因的表达进行相对定量。一般情况下，内参基因的表达值应该与目的基因的表达值接近。如果在 qPCR 实验中发现内参基因的值普遍比目的基因的值大，这可能是由于以下原因之一：1. 选择不合适的内参基因：内参基因的选择是关键步骤，应该选择具有稳定表达水平的基

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问PCR扩增不出来，该怎么改进？

土井挞克树

先排除一下降解问题，感觉是降解的原因所以扩增不出来

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问NCBI引物特异性检测出现以下问题是什么原因？

loveliufudan

主要有以下几点可能原因:1. 引物设计的目标基因在NCBI的小黑麦数据库中没有存档记录。NCBI数据库中小黑麦的序列信息还不是非常完整。2. 引物的特异性不高,除了目标基因,也能识别其他非特异性序列。可以调整引物设计,增强其特异性。3. 目标基因在小黑麦中的表达丰度较低,NCBI中没有收录到这一基因的序列信息。可以考虑在更广泛的数据库或转录组数据库中检索。4. 引物设计的参数需要优化,如Tm值、G

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问荧光定量PCR不起峰

周末也要努力呀

低模板浓度：如果反应混合物中的DNA模板浓度过低，可能无法产生足够的产物来产生荧光信号。这可能是由于样品中的DNA含量过少或提取和纯化过程中的问题。非特异性扩增：由于引物的选择不当或非特异性扩增的存在，可能导致在qPCR过程中产生多个扩增产物。这些产物可能不会产生明显的荧光信号，从而导致缺少清晰的PCR峰。引物设计问题：如果引物的设计存在问题，如引物序列与目标序列的互补度不足、引物长度不合适或引物

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问菌液pcr条带长度计算

土井挞克树

按碱基对的数目计算，多少bp就是多少长度

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问qPCR的Ct值可被接受的区间是多少？是15～30吗？

粥辰辰辰辰

qPCR的Ct值可被接受的区间是15~30

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问TaqmanPCR跑出的曲线荧光值为什么这么低，引物是对的

sswei

这是比较常见的一个问题，反应管内若留有气泡，温度升高后会导致气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低。

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