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        为什么我的qPCR结果内参和目的基因的ct值都很高?

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

        user-title

        dxy_gy7crym8

        我的样本是小鼠空回肠,放在-80四个多月了,期间偶尔被拿出冻融过。用nanodrop测提完的RNA的A260/280在2.0-2.04之间,A260/230在2.27-2.35之间。跑的是384孔板,目的基因为肠屏障相关,包括occludin,claudin,zo1,defensin,muc2,lysozyme。ct值都基本在28-36,内参比目的基因低一点。分为两组,一组是对照组,另一组前期经过营养物质干预。试的几个细胞因子,有IFNY、IL4、IL17、TNFa都扩增不出来。而且组内差异也特别大。对照组数据处理后,2^(-△△ct)的平均值不是大于1,甚至接近2。是我的样本的问题吗?是因为提取过程中RNA降解了吗?

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        3 个回答

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        考虑以下几点原因:

        1)模板量低或基因表达丰度低。

        2)qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当。 3)扩增产物过长。

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        连内参的ct都很高可能是逆转录酶反复冻融或者使用时没有保持低温使酶失效

        user-title

        周末也要努力呀

        有帮助

        考虑样本反复冻融造成RNA降解,所以连内参CT都很高

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