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        PCR扩增不出来,该怎么改进?

        相关实验:巢式 PCR

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        dxy_p4luxqt9

        图片描述


        新反转录的cDNA,新稀释的10uM的引物,无酶水,用的高保真酶,核酸胶的浓度是1%

        尝试试过20ul,25ul,50ul体系,降低过引物浓度,换过其他高保真酶或者taq酶,但是最终跑核酸胶条带都是这个样子。第一孔是marker我想要的条带在倒数第二三marker之间,做过阴性对照没有问题,做过阳性对照也没有问题。希望得到各位老师指点,谢谢。

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        5 个回答

        user-title

        高山云初

        有帮助

        可能原因及解决方案

        一、DNA模板

        1、完整性较差

        建议方法:

        1)在分离DNA时,尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要,可通过 凝胶电泳检测模板DNA完整性。

        2)将DNA保存于 分子级别的水 或 TE缓冲液 (pH 8.0)中,防止被核酸酶降解。

        2、低纯度

        建议方法:

            1)使用纯化试剂盒分离模板DNA时,应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南,改善较低的DNA质量。

        2)如果采用化学或酶促DNA纯化方案,应确保无PCR抑制剂残留,如苯酚、EDTA和蛋白酶K。

        3)使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA,去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子(如, K+, Na+等)。

        4)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶,这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。

        3、用量不足

        建议方法:

        1)检查 DNA起始量 ,如有需要适当增加起始量。

        2)选择具有 高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。

        3)适当增加PCR循环数。

        4、复杂的目的片段(如,高GC含量或含二级结构)

        建议方法:

           1)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶,这类酶对DNA模板的亲和力较高,更适合扩增困难靶标。

        2)使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ,促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。

        3)增加 变性时间或温度 ,从而高效解离双链DNA模板。

        5、长片段

        建议方法:

        1)确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。

        2)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶,这类酶能够在短时间内扩增长片段。

        3)降低退火和延伸温度,促进引物结合和提高酶热稳定性。

        4)根据扩增子长度,增加延伸时间

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        huarenqiang5

        有帮助

        考虑以下几点原因及建议:

        1、酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。


        2、模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。


        3、变性温度是否准确。PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。


        4、反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶。应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。


        5、引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。


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        土井挞克树

        有帮助

        先排除一下降解问题,感觉是降解的原因所以扩增不出来

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        粥辰辰辰辰

        有帮助

        1. 检查 DNA起始量 ,如有需要适当增加起始量。

        2. 选择具有 高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。

        3. 适当增加PCR循环数。

        user-title

        此用户已注销

        有帮助

        样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好,而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利!

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