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        扩增曲线异常-刚跑就有扩增并消失

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

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        dxy_ud0dpda4

        如下图,前10个循环出现扩增曲线并消失,后面的是熔解曲线图片描述图片描述


        现在有几个问题想请教各位大佬

        1、前面的扩增并消失是啥情况?

        2、溶解曲线前面的沟是什么?什么原因造成的?

        3、到达平台期后,扩增曲线下滑是什么原因(这个下滑是同一目的基因,不同样本但模板量相同的情况下,有的下滑,有的无异常)

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        3 个回答

        user-title

        高山云初

        有帮助

        1.扩展失败,应调整反应条件和体系

        2.退火延伸阶段(60度,1min)存在部分链退火不充分;因此在信号刚开始采集阶段,部分链会继续退火形成双链,荧光信号增强,退火充分后荧光信号达到最大值,此后随着温度的上升,pH降低,导致荧光信号强度降低,反映就是出现沟了

        3.意味着扩增产物不再是目标序列,而是非特异性扩增了

        user-title

        此用户已注销

        有帮助

        首先要确定试剂是否有效,包括查看试剂是否在有效期内,是否反复冻融多次,运输条件是否正常。可以通过比较试剂的批次号,结合实验中的阳性对照结果,确定试剂的有效性。

        其次要观察扩增完的试剂体积,如果在扩增过程中有试剂的蒸发,可能会引起扩增曲线抬升现象,如果实验体系中加入了ROX作为参比荧光,ROX荧光可以区分扩增曲线抬升是真扩增,还是蒸发。

        user-title

        周末也要努力呀

        有帮助

        溶解曲线有勾不平滑是特异性不好,去NCBI网站BLAST一下在使用

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