实验问答21,855,097 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问实时荧光定量试验，是否需要均一化处理？

剑藏鞘

内参的选择也很重要

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问怎么 RT－PCR 老不出结果

zhangcs

我的目的基因长度是580bp，第一次三管p出来的也是580bp，污染或杂带也不会这么巧就出现在这个位置吧，另外我用的是同一台pcr仪，同试验室的师兄也用这台pcr仪，没问题呀，至于条件，我做过很多次梯度了，循环次数也改了很多次，由于我的目的基因比较长，4500bp，而且产物片断也比较长，我怀疑是不是目的基因断成小片断了，我因此也重提了很多次RNA,但还是不行呀，我下一步该怎么办，帮帮我吧，谢谢了！

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问如何排除RT－PCR

life

结合个人实验，我觉得有两种方法可以佐证（1）如果你的正反向引物或只有一侧的引物可以设计在EXON的边缘，你可以在设计时，让一个引物的一部分跨过一个内含子，这样从DNA上是拉不到产物的，只有从CDNA上可以得到。（2）验证是否存在DNA污染，你也可以用其他已知基因的引物从DNA和CDNA拉出片段的差异来看你的模板中是否有DNA你可以结合验证，另外DNase消化时要充分

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问关于 RT－PCR 的 RNA 提取

qjm7717

用飞捷的试剂盒试试，15分钟搞定，当然组织可能稍微费时一点。

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问PCR扩增不出DNA

我的头痛不再痛

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问可重复性差，溶解曲线不一致

382 围观

问求PCR结果怎么做出这样的散点图

seuzsl

先求每个样本的2的-Δct，然后所有结果除以对照的均值，就可以作图了

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问qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

seuzsl

理论上讲不同样本内参Ct值的差异并不影响结果解释，因为对于同一个样本而言，目的基因ct-内参ct应该是一个常数，而在提取RNA时，取样量（即，细胞数）存在差异会导致得到的RNA总量有差异，即便通过细胞计数取了等量的细胞，提取时RNA的得率也不同，即便取了相同质量的RNA进行逆转录，不同样本间降解程度、其它rna表达水平都可能会导致内参ct存在差异（当然这种差异不应该很大），这就是为啥一定要做内参，

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问如何进行QPCR中多组数据的统计分析？

香柏树001

相对表达量，我用的是2-△△CT法，每组3各平行要有的，然后得出的Ct值，计算出2-△△CT值就可以了，这样就得出3各2-△△CT，要比较的两组之间求P值就行了。附件讲的比较详细。

1 回答758 围观

问为什么目的基因Ct值正常，反而内参的Ct值很高

杜小涛

引物反复冻融次数多了就有可能降解，不过你这个可以先考虑基因时空表达的问题，如果确定你做的这个时期和组织确定表达量并不低，就有可能是引物反复冻融导致的降解了

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问【求助】PCR实验目的基因的CT值和内参的CT值接近

冰雪芙儿

CT值高，提高模板浓度就行了，我最近也在做，刚开始稀释发现CT值很高，不稀释就好了

2 回答1060 围观

问PCR 结果

午后的红太狼

感觉是因为你提出来的RNA量太少的缘故，从你的内参的CT值可以看出来，可能你要检测的基因本来表达量就不高，内参的CT值不够低的时候，你的目的条带就扩不出来了，大概的看了一下，目的基因有值的那几个，基本都是内参测得比较低的几个，所以建议RNA多提一点，多逆一点，把内参的CT值降到20以下就差不多了

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问【求助】PCR 产物在加样孔里跑不出来怎么回事

xuyongbin

我也曾经遇到这种情况，后来把产物稀释100倍还有，最后我把产物稀释1000倍。取0.5ul，把退火在温度在原来基础上提高2℃就好了，可能是模板量太大的原因。

1 回答1436 围观

问PCR产物电泳条带

sakeiiii

会不会是模板有问题，RNA跑胶了吗？后面这个应该是二聚体或者非特异性扩增？也可能引物有问题

1 回答320 围观

问PCR的CQ值很大?

杨楠520

降低退火温度试试，我降了就可以了

1 回答246 围观

问PCR扩增不出DNA？

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

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问电泳时条带跑出凝胶，是什么情况？

我是金博士

这是你跑电泳时间太长了。

12 回答8697 围观

问荧光定量的 CT 值有正常范围吗？

张法丽

一般在15-35左右，如果数值再大，可能这个基因的拷贝数太低了，表达量太少

12 回答12072 围观

问溶解曲线代表什么意思？

alaling

熔解曲线(Dissociation curve)：随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系（摘自搜搜百科）。白话说来就是因为其中有非特异产物，包含两种以上的DNA序列，所以才有两个峰。当然不排除极度偶然的情况：1.两个序列的熔解曲线一样2.没有目标产物，只有一种非

8 回答22739 围观

问请问 PCR 程序最后给出的 RQ 值是否可以直接用来统计？

qianliu185676911

PCR反应中,CT值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数；RQ值是比较的Ct值。它经过数学公式变形而来。它是判定实验样品中目标靶位点与在标准样品中相同靶位点的表达变化情况。

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