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        可重复性差,溶解曲线不一致

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

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        dogintheair

        向版主及各位高手求教。我是新手做qPCR,但普通PCR做过很多次。可是不知道为什么qPCR 结果出来却是极其的糟糕,扩增曲线呈锯齿状,当然也有少数平滑的,多数都很丑,有的甚至断掉了。溶解曲线呢有的有峰,有的有多个峰,有的峰是倒置的。重复了很多次都是这个结果,而且三个重复孔间Ct值差别很大。真是郁闷。我的操作及反应体系如下。25微升反应体系。 SYBE Green 12.5 微升 Forward Primer(10微摩) 0.5 微升 Reverse Primer(10微摩) 0.5微升 DDW 10.5 微升 cDNA (2微克RNA 反转录后 1:10 稀释加1微升)RNA quality is good 260/280=2.02 260/230=2.14 3个重复孔 一般是准备4个孔的东西全部混在一起,然后每个孔加25微升。 所有的都是这样做的,可是溶解曲线和扩增曲线就那个样子,重复了很多次,都是一个结果。恳请各位帮忙分析一下。
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