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科研学霸天团，48小时有问必答

问求助各位老师，我刚开始学习引物设计，在NCBI里搜乳酸杆菌的基因序列，结果有几万条，需要全部粘贴在Prim

汤姆卜丽波

不用全贴看有认证的，然后选择一个，只贴你需要的就可以了

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问求助：od为2的引物稀释方法？

未来9

1nmol用10ul ddh2o稀释，浓度为100um,此浓度为储藏浓度，工作浓度要稀释到10um.订引物时候，填10nmol就可以了，不用管 od

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问PCR试验中双链互补的问题？

bamboopiggy

在CpG岛两端设计引物进行PCR，pcr过程中，随着pcr引物的延申，T的互补生成A，C的互补生成G，不会不互补

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问用质粒克隆某一DN片段，我我不明白，两端是如何终止的？

bamboopiggy

终止于您的primer binding的位置，没有引物结合，就无法扩增。

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问用BioRad跑RT-PCR，不同的SYBR跑出来的GAPDH会有很大差别么，一个15+一个18+，但是样品差不多，选择哪个

whilt-shirt

可能是试剂的稳定性不太好，建议重新跑一板

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问定量PCR中两步法跟三步法有啥区别？对结果影响大吗？

bamboopiggy

对定量pcr来说：因为产物是短片段，用两步法或三步法影响不大。两步法即循环扩增中设置2个步骤，一个是95度变性，另一个是退火与扩增的温度，一般设置在55~60之间，主要用于扩增短片断，节省时间。三步法就是平常见到的方法，扩增分三步，变性，退火，延伸。时间稍长。

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问双标记探针QPCR问题

dxywode

出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差，可能导致出现抑制 PCR 反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。解决方案：去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线；对目的基因做标准曲线，一般用质粒做梯度稀释，或用 PCR 产物做梯度稀释，然后做定量扩增，通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在 90%-110%；重新纯化模板，去除模板中存在的潜在抑制物。

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问逆转录PCR实验中，逆转录后，一般取多少的cDNA进行后继的PCR圹增？

迟C迟

我们实验室是逆转录之前控制逆转录的量，然后PCR体系中模板量用4微升，一般不超过体系的10%。

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问PCR结果CT值多少比较适合

迟C迟

Actin的CT值一般会小一点，20左右。目的基因看表达，一般低于37/38都还能用，太低可以稀释样本。

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问请问qpcr和pcr本质的区别是什么？怎样诊断呢？

迟C迟

qPCR是荧光定量PCR，相比普通PCR，会加入染料，便于收集荧光信号。结果可以得出相对/绝对浓度等多组数据，然后根据你的目的，对实际数据进行分析。还能通过ntc的ct值判断实验合不合格。一般需要单独的仪器，像Roche 480。

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问怎样解决PCR复合扩增中的扩增不平衡的问题？

dxywode

通过向原有PCR反应体系中加入PCR添加剂，来降低双螺旋DNA的稳定性，从而解决等位基因扩增不平衡的问题；所述原有PCR反应体系为所述对待测等位基因进行PCR扩增出现等位基因扩增不平衡情况时所采用的PCR反应体系。实验证明，该方法确实可以有效的解决由于“部分待测等位基因在PCR扩增过程中解链形成复杂二级结构或/和DNA双链解链不充分”而导致的等位基因扩增不平衡。

3 回答813 围观

问逆转录的CDNA要测浓度吗

bamboopiggy

一般没有人去测cDNA的浓度，因为你同一批rna调整浓度后，同一批次做的反转录认为反转效率是一致的，并且跑realtime以后，可以用内参来继续调整。

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问内参的扩增曲线没有平台期，FAM通道没有问题，这个结果是否可以采用？

bamboopiggy

做realtime一般 pcr的cycle是40，你设置的太少了。还是改一下，用40个cycle，然后看CT值吧

3 回答286 围观

问多重PCR怎么优化，有什么好用的软件吗？

bamboopiggy

我喜欢用neb的Golden Gate 克隆组装设计软件 NEB Golden Gate Assembly Tool，其实用哪个都差不多，你只是要平衡一下退火温度。

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问在dna扩增中，向pcr反应中，加入DMSO作用

bamboopiggy

DMSO可以降低DNA的二级结构，所以通常在扩增GC含量很高的基因样本的时会添加。但是，DMSO 也会大大降低Taq 聚合酶的活性。所以，大家要权衡好模板的accessibility和聚合酶的活性。

3 回答2809 围观

问在做cas9的反转录扩增，使用哪种反转录酶，更容易扩增出来？有没有做过的朋友

天一湖医者

所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的cDNA得率，以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果。可考虑预混液形式的逆转录酶用以可以减少实验误差。

3 回答437 围观

问如何使用KeyPro污染净化仪防止RNA的降解和保证PCR的结果

bamboopiggy

确定不是打广告？KeyPro™KP100生物污染快速净化仪采用SLM™专利技术将LED阵列，光学元件和热冷却技术集于一身，可最大限度地提高消毒和去污性能。进行污染的消除，无残留，免冲洗，可节省高达90％的化学去污时间和成本。只需将适用的试剂和溶液，在加入样品前进行净化即可。产品特点： > 触屏操作，简单易用> 5分钟完成去污操作，通量高> 完全灭活污染物> 稳定，一致的效果

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问提取小老鼠rna,如果rna量过大，应该怎么溶解？

bamboopiggy

用DEPC水或无酶无菌水直接溶解就好，溶解完了，分装保存。注意测浓度的时候，要在机器的浓度范围内，否则会出现很大偏差。

3 回答891 围观

问同一批样本,两次反转录成的cdna，为什么rt-pcr差异那么大？是反转录试剂新旧的问题吗？

bamboopiggy

1.你两次反转录时间间隔多久？时间长了，本身rna就会有降解。2.你反转录的效率每次和每次也是略有差异的，

3 回答1294 围观

问加好的PCR预混液（有聚合酶，没有探针、引物、模板）可以四度冰箱过夜吗。

迟C迟

可以的，现在商业化的酶还是比较稳定的，我们实验室也常预混放四度，当然长时间保存还是建议-20或者-80℃保存。

3 回答633 围观

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