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科研学霸天团，48小时有问必答

问荧光定量PCR反应体系

bamboopiggy

500ngrna反转后，稀释到200ul，取4ul上样

4 回答676 围观

问引物设计一定从启动子开始吗？

dxy_np1w2as6

这题我会！不一定要从起启动子开始，可以从网站上查找目的基因mRNA的序列，之后从启动子两端的序列设计引物，这样可以选择很多引物配对，但是最后扩出来的序列一定要包含你的CDS区

5 回答3579 围观

问pcr扩增曲线有异常，总出现s型曲线

bamboopiggy

检查是不是都是在同一个孔，可能是这个孔被污染了，或者是热板盖歪了

3 回答678 围观

问跑pcr，怎么避免非特异性条带

bamboopiggy

注意annealing temperature，可以适当提高

4 回答563 围观

问PCR的产物总是太少，是什么原因?

bamboopiggy

看看你是不是酶啊，引物啊，或者是模版加的浓度不对

4 回答722 围观

问pcr引物可不可以mix之后保存？

bamboopiggy

可以将pcr引物稀释后，按照1:1的浓度mix保存

5 回答1195 围观

问提取细菌RNA需要去除基因组DNA吗？

bamboopiggy

需要去除基因组DNA，否则对实验结果有影响。

7 回答1327 围观

问PCR产物需不需要凝胶纯化?

bamboopiggy

如果下一步要酶切，连接之类的，是需要纯化的

3 回答398 围观

问验证质粒是否导入感受态是应该做pcr电泳还是直接做测序好呢？

bamboopiggy

都可以，一般会选择pcr鉴定，但是现在有些实验室有钱。就直接送测序

4 回答508 围观

问自己引物设计软件和文献报道不一样

bamboopiggy

只要引物好用，不用管是不是和文献报道的一样，只管用

6 回答661 围观

问rtPCR引物长度336bp可以用作引物吗？

bamboopiggy

可以用作rtPCR的引物，因为你已经找不到更合适的了，产物稍微长一点也是可以的。注意一下你的延伸时间就好

4 回答508 围观

问引物设计提示多条合适，如何从中选择最优的

bamboopiggy

不用，你可以选比较靠前的引物，产物长度在50-200bp左右u

5 回答656 围观

问如何选择多重荧光定量pcr的报告基团和淬灭基团，选择原则是什么？淬灭基团是不是一样比较好？

天一湖医者

根据荧光定量PCR仪荧光通道，选择适配的荧光基团，优先选择常用的荧光基团，如FAM、VIC或CY5等；2. 根据荧光基团类型选择淬灭基团。早期的淬灭基团TAMRA，自身会发出荧光信号，干扰检测结果，后续慢慢地被其他淬灭基团替代。目前淬灭基团最常用的就是BHQ、NFQ-MGB或QSY等；3. 进行多重qPCR检测时，每个通道要选择不同的荧光基团，且避免各标记基团的激发和发射波长重叠，出现荧光干扰的情

3 回答6497 围观

问有没有一款软件可以分析多重荧光定量pcr的引物是否会相互干扰及量化干扰程度？

Eason老歌迷

有的，可以参考https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

4 回答287 围观

问进行PCR实验，SSⅢ与SSⅡ有何不同？

bamboopiggy

SSIII 是一种基因工程化的 MMLV 逆转录酶 (RT)，它通过引入几个突变来降低 RNase H 活性、延长半衰期和提高热稳定性。 SSIII RT 提供更高的 cDNA 产量、更长的 cDNA 长度、更高的 GC 丰富靶 RNA 效率，以及比野生型 MMLV 和 MMLV RNase H-minus 酶更好的整体性能。SS II也是一种基因工程化的 MMLV 逆转录酶 (RT)，与野生型

2 回答673 围观

问PCR中关于cDNA的一点疑问

balalaLy

cDNA一般很少出问题，除非反复冻融次数太多，条带越来越淡有没有可能是你的酶出现问题了？酶反复使用过程中没有注意低温操作也容易成问题

6 回答2657 围观

问RTPCR实验高浓度的cDNA会对最终结果造成影响么？

bamboopiggy

模版浓度太高，可能与引物结合不完全，也可能很早就达平台期，看不出差别。一般要求酶和引物是过量的

7 回答1698 围观

问求助，半定量PCR的问题

bamboopiggy

半定量PCR是首先通过确定目标物PCR有限扩增至最大值的最低循环数，进而比较不同样品之间该目标物的PCR扩增产物数量，以此确定样品中目标物的相对数量。也就是说是一个相对值，不是绝对含量。至于第二个问题，完全一样的操作，并不代表完全一样的模版都加进去了，每加一次样，都可能存在误差，甚至没有吸到液体。

5 回答1429 围观

问PCR实验引物设计有什么要求？TM值一般多少最合适？

汤姆卜丽波

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过 5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为 72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任

5 回答22418 围观

问Pcr模板加的量太多会导致产物多条带，且不亮吗

bamboopiggy

按照你的酶的说明书来加pcr模板的量，加多了，会产生非特异性结合，产物条带多，且不特异。

3 回答3911 围观

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