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科研学霸天团，48小时有问必答

问PCR 管材质厚度不一，是不是厚点的稳定性更好呢？

bamboopiggy

这个和管壁的厚薄没啥关系，主要取决于你用的盖或膜的透光性。

3 回答166 围观

问PCR 封板膜有好多种类型，哪种实验效果更好呢？

bamboopiggy

其实都可以，只要你每次实验用的都是同一个牌子的就没有问题，还有就是你自己封，要封紧。虽然这么说，我还是推荐用国外大品牌的，透光度和密闭性都好一些

3 回答333 围观

问qPCR的内参应该怎么选

汤姆卜丽波

内参主要的作用就是校正和标准化，

4 回答1296 围观

问real time RT-PCR如何保证重复性

bamboopiggy

这个不是污染不污染的，只要你加样准，一般问题就不大，加样准，前提是枪和枪尖要match，保证每次加进去的样本量是一致的

4 回答437 围观

问在菌落PCR时能够获得条带但是测序并没有该序列是什么原因？

bamboopiggy

可能是你的seqA有复杂结构，测不过去，你试试从你的insert seq中设计测序引物，分别往两端p，能不能把两个seq给p出来

3 回答2665 围观

问overlap PCR时有一段序列怎么都连接不成功都有可能是什么原因？

bamboopiggy

实在不行的话，把另外两段构建好的情况下，用酶切的方法，插入第三段。

3 回答579 围观

问加尾法逆转录miRNA的qPCR如何区分前体和成熟体？

汤姆卜丽波

前体和成熟体的大小序列都不一样。除非你特别设计不同引物，不会一起扩增

4 回答459 围观

问如何通过qpcr.测定基因敲除鼠基因的表达情况(主要是样品浓度不太一致)

bamboopiggy

收样品，然后提RNA，调整浓度，做逆转，然后跑qpcr，与内参值进行比较。其实你是基因敲除，做wb可能更能说明问题。

3 回答198 围观

问RT值过高。最近实验细胞给药后杀伤效果跟之前相近，但同样方法下做出的RT值过高，有时候能超过40，大家帮忙提提问题

bamboopiggy

你说的是CT值过高吧？超过40基本代表没有什么表达了。要不你试试降低药物浓度，有部分细胞能活的情况下做这个实验。

3 回答436 围观

问反转录同样按试剂盒建议量加，之后由SYBR染料法改为taqman探针法，结果曲线非常乱，不具有特异性，怎么改进

bamboopiggy

跟反转录和sybr的关系不大，可能是你taqman探针法的引物有问题

4 回答472 围观

问【扩增启动子】有时候同样的条件，第一次能扩增出来有单一明亮的条带，第二次就没有条带，这是什么原因呢？对于启动子扩增有什么建议吗？

汤姆卜丽波

没有条带的话，是不是操作过程中导致样本降解了

4 回答158 围观

问易错pcr 可以用普通的pcr mix 做吗？

汤姆卜丽波

不可以的。易错pcr体系中用到的镁离子浓度和普通的不一样，还要加锰离子提高突变率

4 回答583 围观

问做qpcr 时候设计引物一定要垮内含子嘛？

dxy_jrj59zn3

你的意思是引物设计在两个外显子的连接点上吧？其实可以把两条引物分别在两个外显子上，这样应该会比较好

5 回答1370 围观

问定量PCR和半定量一般对象检验的周期在多久

汤姆卜丽波

定量pcr一般两小时，大约40个循环。半定量的话就看你的实验目的，最多不超过35个循环。

4 回答392 围观

问overlap pcr 如何设计引物？有何注意事项？

汤姆卜丽波

重叠延伸pcr的引物设计:引物F及R为基因两端特异引物，其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列（至少10bp完全匹配），为突变点，突变点最好是位于引物的5’端，尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因为Taq酶容易在PCR 产物末端加A，会造成产物移码突变。其余标准和普通pcr一致的

4 回答13891 围观

问求助：跑pcr整不出来？

Eason老歌迷

如果你测序有，但是扩增不出来，可能是模板dna被降解了?引物的浓度问题，引物设计的是不是合理等

4 回答206 围观

问RT－pcr，整出来是一条直线，怎么回事？

whilt-shirt

有可能是程序原因，你可以先逆转录，然后再PCR试试。

4 回答185 围观

问反转录pcr试剂盒中随机引物合成片段的原理是什么，大小会不会不一样

bamboopiggy

随机引物：某些特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列，比较难以转录成全长序列时，可采用非特异的随机引物来转录全长mRNA。选择这种引物，体系中所有RNA分子会全部充当DNA第一链模板，然后PCR引物在下游扩增过程中再扩增特异的目的基因。通常，用此引物合成的cDNA中，96%来源于rRNA。Oligo(dT)：绝大多数真核细胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾，所以使用Oligo(dT)仅mR

3 回答926 围观

问Trizol法提取的Rna模板不经过dna酶消化可以直接用于rt-qpcr吗

whilt-shirt

可以直接用，但是可能会有污染。

4 回答312 围观

问菌液Pcr反应中，一般最少多少个循环可以得到可视条带的浓度。

whilt-shirt

一般35个循环就能看到条带了。

4 回答469 围观

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