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        overlap pcr 如何设计引物?有何注意事项?

        相关实验:重叠延伸 PCR

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        pooh0216

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        4 个回答

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        汤姆卜丽波

        有帮助

        重叠延伸pcr的引物设计:引物F及R为基因两端特异引物,其中Fm及Rm为中间引物。其中引物Fm及Rm中间共享一段序列(至少10bp完全匹配),为突变点,突变点最好是位于引物的5’端,尽量避免出现在3’端。然后分别用引物F和Rm及Fm和R进行配对进行PCR。该步一定要用pfu酶,不能用Taq酶,因为Taq酶容易在PCR 产物末端加A,会造成产物移码突变。其余标准和普通pcr一致的

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        bamboopiggy

        有帮助

        前一段的正向和后一段的反向,每一段至少要有15个bp的overlap,注意一下退火温度不能相差太大

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        天一湖医者

        有帮助

        1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。

        2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过5℃。

        3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为72℃左右。

        4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰,且 3’端的碱基一般不用A;引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

        5、碱基要随机分布,且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

        6、尽量在基因的编码区(CDS序列)上设计引物,限制基因组DNA扩增。

        7、使用BLAST检索,确认引物特异性。

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        Eason老歌迷

        有帮助

        应该有如下注意事项:1.两段DNA片段Overlap的部分应该不少于15个碱基;2.鉴于您扩增的片段比较长,应该考虑用扩增长片段的DNA聚合酶3.如果片段GC含量过高,应加入GC Buffer;4.不用先不加两端引物跑10个循环,再加入引物跑20个循环。可以直接加入两段片段和上下游引物进行30-35个循环的PCR;5.两段片段的量不应加入过高,如果是第一轮PCR产物的话,应稀释50倍然后各取1 ?l当作模板;如果是纯化后的产物,加入的量在1-10 ng左右为宜;6.采取上述手段仍无产物,可能是PCR的退火温度不适宜。建议通过梯度PCR摸索条件。

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