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实验问答23,616,082 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

PCR

问扩增的蛋白在5000左右，怎么扩增，为什么我的总是弥散

Eason老歌迷

总是出现弥散的话可能是在PCR反应体系中一链产物的含量过高，你可以减少引物的用量，减少PCR的循环次数，在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。

3 回答305 围观

问PCR实验结果发现目的蛋白无CT值是什么原因

天一湖医者

原因:反应循环数不够一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环（如至45循环），但高于45个循环会增加过多的背景信号检测荧光信号的步骤有误一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解可通过PAGE电泳检测其完整性模板量不足对未知浓度的样品应从系列稀释样本的zui高浓度做起模板降解避免样品制备中杂质的

3 回答1110 围观

问miRNA茎环法扩增不出来

秋秋欣欣

确定是引物的问题吗？可以先用别的扩增排除一下是引物还是其他东西的问题

3 回答570 围观

问qpcr要测RNA浓度吗orz

秋秋欣欣

需要，逆转录的时候需要根据浓度计算加样量

4 回答796 围观

问做小干扰之后跑pcr，这个结果意思是没干扰成功么

秋秋欣欣

没差异就是没干扰成功啊，干扰成功表达量会下降

4 回答396 围观

问RT-PCR的相关问题？

bamboopiggy

只合成第一链就可以做RT-PCR，随着扩增过程，会形成第二链的。

3 回答583 围观

问扩增曲线没有到达平台期可以么，会影响分析么，需要一定有平台期么？

凌晨三点Dxy

起始模板浓度太低，或循环数不够，当然循环数一般参照说明书不会有大问题，而且循环数多了会增加非特异性扩增

5 回答604 围观

问QPCR实验平行孔Ct值差别太大是什么原因？要怎样进行调整？平行孔之间Ct值要保证偏差在多少之间才可以，有标准么？

Eason老歌迷

ct值差别大，可能是模板浓度低或存在PCR抑制物，或者是你的pcr扩增效率低。Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

5 回答1067 围观

问Qpcr扩增内参和指标的CT值相差太多怎么办？内参Ct是13，指标Ct是30

Eason老歌迷

相差太大的话，你重新p一次吧，Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

3 回答415 围观

问扩增曲线平台期不平，循环增加荧光值下降是什么原因？

Eason老歌迷

有可能是你的仪器不稳定导致的扩增曲线异常。或者是可能是卤素灯老化所致发射光源不稳。或者是考虑仪器或者孔位问题，还要考虑反应体系是否存有气泡。

3 回答267 围观

问qpcr结果_溶解曲线

bamboopiggy

感觉是加样不稳，或者是cDNA的质量有问题。

3 回答652 围观

问PCR没有想要目的条带只有其他条带

天一湖医者

最常见是引物不特异，如果引物与模版其他地方结合，扩出来的指定不是你想要的大小；其次考虑模版问题，如果模版本身有大规模重复（很长的重复或串联重复），扩出来的东西也可能会多一段或少一段。然后考虑酶的活性，

3 回答602 围观

问病例组和正常人的qPCR结果数据应该怎么处理呢

bamboopiggy

感觉你看的这两种方法都有问题，应该是每个样本的Δct减去这个均值得到ΔΔct。然后计算得到2的ΔΔct，然后可以用t-test进行组间比较就可以。

3 回答671 围观

问请大佬看一下qpcr amplification plot曲线

天一湖医者

一是扩增信号太弱，经系统矫正后，就产生这样抖啊抖的线，小 V 建议大家提高模板浓度重复实验。二是仪器本身的问题，可能在扩增过程中仪器出现了波动或者本身该检测孔出现了异常。

4 回答1054 围观

问人群PCR分组计算怎么计算

bamboopiggy

这个需要每个sample计算自己的delta delta ct值，所以几百个人和一个人的算法都一样

3 回答480 围观

问NCT如果要测好几个基因，加哪个基因的引物呢？

bamboopiggy

NCT针对每个基因都要做的，所以你每个都要加

3 回答488 围观

问在跑完定量PCR后，如何处理相对定量数据？

Eason老歌迷

qPCR的数据相对定量分析其实很简单。分享一下自己的经验，最常用，最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法，该法最最简单的说就是：首先将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）；然后，将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好，整理进Excel，用本次实验中待研究样本的△C

3 回答1258 围观

问为什么同样的复孔，会有不同的平台期，即平台期分散？

Eason老歌迷

可能是，你pcr纯化不够，出现了不同产物。

3 回答511 围观

问qpcr求助，溶解曲线双峰

yaonan120

这个基因做了第一次正式实验，发现80度那里提前出来一个峰，觉得是引物二聚体。条件不变，再做一次还是差不多这样。不知道这是不是真的就是引物二聚体还是其他原因？如果是应该改怎么改变反应条件才能不产生引物二聚体？反应体系如下：10ul体系 95度30秒 95度5秒 59度30秒 40个循环SYBR mix 5FP 0.4RP 0.4H20 3.2CDNA 1

4 回答6877 围观

问进行RT-PCR需要将样本RNA浓度调成一致再进行接下来的实验吗？

Eason老歌迷

最好是把浓度统一一下。RT-PCR的目的是看目的基因在不同样品中的表达量。因此，比较的前体必须是所有样品的总RNA量必须相同或接近相同，通常的做法是用内参基因的表达近似得来反应总RNA的量。

4 回答1458 围观

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