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miRNA茎环法扩增不出来
秋秋欣欣
确定是引物的问题吗?可以先用别的扩增排除一下是引物还是其他东西的问题
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问
qpcr要测RNA浓度吗orz
秋秋欣欣
需要,逆转录的时候需要根据浓度计算加样量
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问
做小干扰之后跑pcr,这个结果意思是没干扰成功么
秋秋欣欣
没差异就是没干扰成功啊,干扰成功表达量会下降
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问
RT-PCR的相关问题?
bamboopiggy
只合成第一链就可以做RT-PCR,随着扩增过程,会形成第二链的。
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问
扩增曲线没有到达平台期可以么,会影响分析么,需要一定有平台期么?
凌晨三点Dxy
起始模板浓度太低,或循环数不够,当然循环数一般参照说明书不会有大问题,而且循环数多了会增加非特异性扩增
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问
QPCR实验平行孔Ct值差别太大是什么原因?要怎样进行调整?平行孔之间Ct值要保证偏差在多少之间才可以,有标准么?
Eason老歌迷
ct值差别大,可能是模板浓度低或存在PCR抑制物,或者是你的pcr扩增效率低。Ct值的范围为15-35。Ct值小于15,认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值。理想情况下,Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,也就是标准曲线。通过标准曲线,扩增效率为100%时,计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右,若大于35,理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义。
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问
Qpcr扩增内参和指标的CT值相差太多怎么办?内参Ct是13,指标Ct是30
Eason老歌迷
相差太大的话,你重新p一次吧,Ct值的范围为15-35。Ct值小于15,认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值。理想情况下,Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,也就是标准曲线。通过标准曲线,扩增效率为100%时,计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右,若大于35,理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义。
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问
扩增曲线平台期不平,循环增加荧光值下降是什么原因?
Eason老歌迷
有可能是你的仪器不稳定导致的扩增曲线异常。或者是可能是卤素灯老化所致发射光源不稳。或者是考虑仪器或者孔位问题,还要考虑反应体系是否存有气泡。
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问
qpcr结果_溶解曲线
bamboopiggy
感觉是加样不稳,或者是cDNA的质量有问题。
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问
PCR没有想要目的条带只有其他条带
天一湖医者
最常见是引物不特异,如果引物与模版其他地方结合,扩出来的指定不是你想要的大小;其次考虑模版问题,如果模版本身有大规模重复(很长的重复或串联重复),扩出来的东西也可能会多一段或少一段。然后考虑酶的活性,
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问
病例组和正常人的qPCR结果数据应该怎么处理呢
bamboopiggy
感觉你看的这两种方法都有问题,应该是每个样本的Δct减去这个均值得到ΔΔct。然后计算得到2的ΔΔct,然后可以用t-test进行组间比较就可以。
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问
请大佬看一下qpcr amplification plot曲线
天一湖医者
一是扩增信号太弱,经系统矫正后,就产生这样抖啊抖的线,小 V 建议大家提高模板浓度重复实验。二是仪器本身的问题,可能在扩增过程中仪器出现了波动或者本身该检测孔出现了异常。
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问
人群PCR分组计算怎么计算
bamboopiggy
这个需要每个sample计算自己的delta delta ct值,所以几百个人和一个人的算法都一样
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问
NCT如果要测好几个基因,加哪个基因的引物呢?
bamboopiggy
NCT针对每个基因都要做的,所以你每个都要加
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问
在跑完定量PCR后,如何处理相对定量数据?
Eason老歌迷
qPCR的数据相对定量分析其实很简单。分享一下自己的经验,最常用,最普遍的相对定量方法就是2^-△△Ct法,该法最最简单的说就是:首先将一次实验的所有基因Ct值整理好,之后用每一组样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct;换成公式就是:△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);然后,将每一组样本每一个目的基因的△Ct都算好,整理进Excel,用本次实验中待研究样本的△C
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问
为什么同样的复孔,会有不同的平台期,即平台期分散?
Eason老歌迷
可能是,你pcr纯化不够,出现了不同产物。
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问
qpcr求助,溶解曲线双峰
yaonan120
这个基因做了第一次正式实验,发现80度那里提前出来一个峰,觉得是引物二聚体。条件不变,再做一次还是差不多这样。不知道这是不是真的就是引物二聚体还是其他原因?如果是应该改怎么改变反应条件才能不产生引物二聚体?反应体系如下:10ul体系 95度30秒 95度5秒 59度30秒 40个循环SYBR mix 5FP 0.4RP 0.4H20 3.2CDNA 1
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问
进行RT-PCR需要将样本RNA浓度调成一致再进行接下来的实验吗?
Eason老歌迷
最好是把浓度统一一下。RT-PCR的目的是看目的基因在不同样品中的表达量。因此,比较的前体必须是所有样品的总RNA量必须相同或接近相同,通常的做法是用内参基因的表达近似得来反应总RNA的量。
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问
如下图,跑的一个转录因子hes5,没有溶解温度,溶解曲线也不正常,求分析原因。用的条件附上了,提问者其他分子均跑出,技术比较稳定
汤姆卜丽波
这就是引物不对啊,你是不是用错了引物或者引物降解失效了
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问
qPCR
balalaLy
一般就是看CT值高不高,和溶解曲线是不是单峰,miRNA CT24 说明表达量也不低呢。
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