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求助QPCR扩增曲线和熔解曲线起点高的问题!
Dr_劉医生
起点过高,可能是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误,引起了扩增曲线抬升。建议手动调整基线,即可正常
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问
ABI7500机器无法关机是为什么呀
Dr_劉医生
荧光PCR如果没在工作的会,应该是可以正常关闭的。如果是公共平台的仪器,建议咨询技术员,或者自行联系厂家的人员
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问
求助,荧光定量无CT值
juyue2010
可能是没有设置,在每一个循环收集一次荧光信号
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问
逆转录添加RNA时,所有样本的RNA的量要相同吗?
balalaLy
要,一般用500-1000ng的RNA。
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问
家人们!为什么跑q一直跑不出来啊,应该不是cDNA不行,actin一直很齐
juyue2010
1.引物设计的可能有问题2,退火温度不正确
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问
定量的内参结果重复性比较好,但是样品的重复性很差,是什么原因?
genecreate
是不是目标基因的表达量在同组不同样本中,本来就差异较大
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问
请问有没有undefined到undefined的DNA聚合酶
土井挞克树
DNA聚合酶III这种酶既有5’→3’方向聚合酶活性,也有3’→5’核酸外切酶活性。该酶的活性较强,为DNA聚合酶Ⅰ的15倍,DNA聚合酶Ⅱ的300倍。他能在引物的3’-OH上以每分钟约5万个核苷酸的速度延长新的DNA链,是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。
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问
各位大神,想问一下qPCR扩增曲线中为什么会有弧形的曲线?怎么解决?
今晚月色真美_
模板浓度过高,预变形时间不足,引物不特异等等原因。你调整下上述因素重新扩增试试
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问
提取RNA做逆转录,然后用逆转录的c DNA做荧光定量PCR。结果发现没有扩增成功,一直在0上下波动,是什么原因呢?
灵枢天问
是不是你的SYBR出了问题,失效了或者提出来的RNA降解了
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问
qPCR的图方差很大怎么办?
juyue2010
若是技术重复导致的话,是操作问题,先做好mix,再分别加到每个孔,操作时间别太长,加好样直接上机。若是生物重复导致的话,那就是说样品处理平行度差
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问
小鼠GAPDH内参可以扩大鼠吗
Dr_劉医生
可以用,鼠源的管家基因都是同源的,GAPDH都可以用
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问
第二次pcr跑出来的条带和第一次pcr跑出来的位置不一样,这是什么原因?
灵枢天问
可能是第一次的RNA有降解,逆转录出来的模板本身就有问题,所以p出来条带也有问题,太小了,你可以发个图片过来看看
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问
在做PEDV、TGEV鉴定时,需要阳性对照,可以用该病毒的疫苗做阳性对照吗
土井挞克树
一般都是用野毒株做阳性对照的。
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问
家人们,qpcr的数据p值是在grafpad里面算出来,直接标在数据上吗
juyue2010
graphpad统计分析后,在图上添加
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问
meta分析
Dr_劉医生
完全可以,你只提取A,B方案的原始数据进行分析就可以,但RCT的纳排标准得符合
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问
CasRx系统引物设计
土井挞克树
1.sgRNA设计1.1设计原则1) II型CRISPR系统(SpCas 9)的sgRNA 靶点一般为20nt2)sgRNA序列的碱基组成:基因特异的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前,PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)3)sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾,GC%含量为30%-70%4)sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高。5)
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问
自己做的兔抗多克隆抗体,在目的条带的位置出现非特异性条带怎么解决
土井挞克树
这样就需要调高筛选精度,尽量把非特异性条带筛选掉
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问
求助:qPCR的溶解曲线分析
juyue2010
没什么问题,溶解曲线,是求导得出的,前边双链数量变化很小
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问
qPCR标曲低浓度曲线分不开,模板超声没用
土井挞克树
建议更换引物探针,高重复性容易导致曲线不明显
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问
为什么PCR不加模板,只加水也会有条带,可能是单引物扩增的产物吗?
dxy_0n2bux32
如果片段比较小的话有可能是引物二聚体,片段大的话可能是污染了
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