CasRx系统引物设计

1.sgRNA设计

1.1设计原则

1） II型CRISPR系统（SpCas 9）的sgRNA 靶点一般为20nt

2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)

3）sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量为30%-70%

4）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高。

5）如果构建U6启动子或H1启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。

6）如果想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上，这可以保证蛋白尽可能多的功能域或结构域失效。

7)基因有多个转录本时尽量设计在各转录本的公共区域。

2.常用设计软件和设计流程

1）Broad Institute GPP

网址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design

2）Benchling

网址：https://www.benchling.com/crispr

Benchling和张锋实验室设计网站都是比较全面和权威的sgRNA设计网站，以人源TP53基因为例介绍Benchling设计流程