为什么构建质粒目的基因片段缺失了一部分

我构建的质粒送测发现目的基因只有前段和后段，中间有一大段缺失了（目的基因2000多bp缺失了大约1000bp），构了五个不同质粒全部是这种情况，这是为什么。我的目的基因送测过是正确的，用的双酶切酶连法，会是因为我转化涂板培养时间太长了吗，培养了大约16h但是我没有即时菌p，在4度放了一天才做菌p摇菌。