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        🔥 重组酶构建质粒

        相关实验:质粒构建技术

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 张荣钊博士

        病原生物学 福建医科大学

        简介

        基于同源基因重组原理,适用于向几乎任何载体在任何位点进行定向克隆,无需考虑插入片段自身携带的酶切位点可高效克隆 50bp~10kb 片段,同时构建时间也大大缩短。

        材料与仪器

        DNA片段、引物、限制性核酸内切酶

        DNA 连接酶

        步骤

        1. 载体的制备一般推荐双酶切线性化,线性化完全,假阳性克隆低。在 200 μl 的离心管中,加入以下试剂:

        试剂                              体积

        载体                              1~2 μg

        酶切缓冲液(10×)       5 μl

        内切酶1                         1 μl

        内切酶2                         1 μl

        ddH2O                          to 50 μl

        混匀后,点动离心将反应液甩至管底。37 ℃ 保温 2 h 进行酶切反应。

        2. 对于使用重组方式连接来说,PCR 要设计引物, 设计引物时要根据质粒载体和基因序列选择合适的同源序列,通过 PCR 扩增方式进行连接,PCR 的产物要纯化。

        3. 目的引物与线性载体进行重组反应。

        4. 转化。将连接产物转化到受体菌中(一般为 DH5a),涂板,培养过夜。

        5. 挑取单克隆,并鉴定。挑取平板上的单克隆培养,可以通过 PCR 或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步鉴定出来的阳性克隆进行测序。

        来源:丁香实验

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