• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        目的基因片段的回收

        互联网

        5685
        相关专题
         

        6.1实验原理
        DNA片段的分离与回收是基因工程 操作中一项重要的技术,如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制备探针,回收PCR产物用于再次鉴定等。理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求:
        (1)回收片段应有非常高的纯度
        如从普通凝胶中分离出来的片段不可带有即使是微量的凝胶――凝胶会抑制大部分的酶活力,对于后续DNA片段用于再酶切分析或连接均是不利的。
        (2)回收过程必须是严格的无DNA酶污染的操作过程
        衡量的Dnase均可能使回收的目的DNA片段降解,当降解作用仅发生在粘性末端时,在凝胶电泳中是无法看到回收的DNA片段有任何差异,但会导致DNA连接 实验的失败,最终影响后续的克隆实验。
        (3)能回收不同大小的DNA片段
        对于采用的回收方法必须能对不同大小的DNA片段均能回收,当回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用,造成大片段断裂。
        (4)回收效率要高
        回收方法要能对微量DNA也能进行操作,也即回收效率相对要较高,则对于实验中获得的非常微量的DNA样品也可进行分析。
        (5)操作简单、快速
        在回收过程中一般不需特殊的实验设备,也不需要昂贵的试剂,并且操作时间较短,象现在常用的试剂盒回收在电泳完成后整个回收过程只需30min左右,并且样品的回收率可达50%。
        6.1.1各类常用回收方法
        由于分离方法众多,且各种不同的方法可能同时依据多项原理,所以只能粗略地将各种方法分成五大类:电泳法、收集孔法、机械破碎法、溶(熔)胶法与酶处理法:
        一、电泳法
        根据凝胶割否分透析袋法与流动电洗脱法(割胶),滤纸-透析膜法与DEAE膜法(不割胶)。
        (1)透析袋法
        该方法可回收大于5kb的片段,缺点是操作麻烦并易造成DNA酶的污染。
        (2)流动电洗脱法
        该方法回收片段大小为4~50kb,且回收效率高达94~100%,极端条件下可回收大至550kb的片段。缺点是操作繁琐,而且为了取得较高的回收率,需特定的流动电洗脱槽。
        (3)滤纸-透析膜法
        回收率平均达70%左右,不需割胶,操作相对简单,但实验中需将滤纸上的DNA洗脱,也较繁琐,也不易控制。
        (4)滤纸-透析膜法
        此方法用于回收小片段,一般小于5kb的片段回收效率较高,可达70%以上;对于大片段(>15kb)则难以从DEAE膜上洗脱下。
        二、收集孔法
        (1)蔗糖法
        回收小片段效率较高,564bp的PCR 产物带回收效率高达97.6%,并且回收中能将较宽的条带浓缩于收集孔中,但回收中制作收集孔较麻烦,并且收集孔中要加入蔗糖,故获得的DNA样品不能直接用于后续实验。
        (2)羟基磷灰石法
        该方法回收效率也较高,不利之处与上述方法相同,获得的DNA需再纯化,操作也较繁琐。
        三、机械破碎法
        指用机械力将凝胶压碎后再行回收DNA片段,有冻挤法,冻融法、压碎浸泡法、(单层)滤膜过滤法及双层(亲和)膜过滤法。
        (1)冻挤法
        将胶条割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中,冰冻30min后全速离心5min,收集清液,再经酚抽提、乙醇沉淀等纯化浓缩处理(也可直接沉淀)。其基本原理理是利用离心力将凝胶中原有的液体挤出,同时也带出胶中的DNA。从胶浓度为1%琼脂 糖中回收650bp、1.1kb、2.0kb、4.5kb的片段时,回收率分别为90%、74%、56%、30%。这是因为大分子DNA更难于被胶中的缓冲液带出,所以此法只适用于回收较小的DNA片段。
        (2)冻融法
        割下的胶条放在eppendorf 管中,将之捣碎并放于-80℃冰冻5min,取出后迅速放置于37℃保温10min,如此反复3次能使DNA从胶中游离出来,离心获得上清中即含有目的DNA,可通过沉淀浓缩获得高浓度。对一般的DNA片段回收效率在60~80%。操作简单,并不需特殊设备。
        (3)压碎浸泡法
        又称醋酸铵法,操作较费时,回收效率较低,一般改良的方法是在冻挤法操作中,加入一定的水并浸泡10min,增加DNA的回收率。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序