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        🔥 同源重组法构建质粒

        相关实验:质粒构建技术

        别名:质粒构建,同源重组法质粒构建

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 张璞博士

        动物医学 中国农业大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 郭雅婕博士

        生物化学分子生物 中国科学院大学

        简介

        质粒的构建是分子生物学研究中常用的实验技术,质粒是能够自主复制的环状 DNA 分子,将特定的基因序列插入到工程质粒中,再把质粒转化到细菌、细胞或酵母中,使质粒在其中表达。

        原理

        将选定的目的外源基因(DNA)经过 PCR 扩增后,用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段,再使用 DNA 连接酶将切割后的载体与 DNA 片段连接,转入宿主细胞。最后经过筛选和测序鉴定出正确的重组克隆质粒,实现目的基因在宿主细胞内的表达。

        用途

        外源蛋白的过表达。

        材料与仪器

        目的片段的 cDNA,引物,载体,限制性内切酶,酶切 buffer,LB 培养基,含 LB 培养基的细菌培养皿,同源重组酶,高保真酶,感受态细胞 DH5α,胶回收试剂盒,质粒小提试剂盒,EP 管,离心管,移液枪及枪头等。

        步骤

        同源重组法构建质粒的步骤如下:

        1、根据目的片段的酶切位点,选择响应的内切酶,通过双酶切法将环状载体质粒切割成线性化载体,用琼脂糖凝胶法回收酶切产物,回收方法按照试剂盒操作。

        2、用 PCR 法扩增目的片段的序列,用琼脂糖凝胶法回收扩增产物。

        3、将线性化的载体与扩增的片段按比例进行连接,37 ℃,30 min 或更长时间(1~2 h)。将连接好的重组质粒(10 μl)转入克隆感受态细胞 DH5α,轻轻吹打均匀,切勿振荡混匀,冰上静置 30 min,然后 42 °C 水浴热激 90 s,立即置于冰上静置冷却 2~3 min。

        4、加入 500 μl 不添加抗生素的 LB 液体培养基,37 ℃ 摇菌 1 h, 转速 250 rpm。

        5、将上一步的菌液 5 000 rpm 离心 5 min,弃掉 300 μl 上清。用剩余培养基将菌体重悬,最好按不同梯度涂板,防止单克隆菌过密或过疏,用无菌涂布棒在含有质粒抗性的平板上涂匀后,置于 37 ℃ 培养箱中培养 10~12 h。

        6、过夜后,用 1 μl 枪头挑单克隆菌,置于 5 ml 的含抗生素的 LB 液体培养基中,继续培养 10~12 h。

        7、质粒小提试剂盒提取菌液中的重组质粒后,用限制性内切酶消化后,进行琼脂糖电泳做酶切鉴定。

        8、第 7 步的同时,可以吸取部分菌液做菌液 PCR,PCR 产物琼脂糖凝胶电泳看条带大小,进一步鉴定重组质粒是否正确。

        9、将鉴定成功的菌液送测序公司进行双向测序,待序列结果比对正确后,表示重组质粒构建成功,可以进行下游实验。

        注意事项

        1. 构建质粒时,目的基因的片段不要大于载体的长度,如果基因片段为载体长度的 1/2 以上,会加大连接的难度。

        2. 如果后续的质粒要做蛋白表达,那么在一开始选择载体的酶切位点时,就要注意是否会发生移码突变,否则后续蛋白表达会出错。

        3. 同源重组法的引物设计需要在插入片段正/反向 PCR 引物 5' 端引入线性化载体的末端序列,使得 PCR 产物 5' 和 3' 最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列 (15~20 bp),同源臂的 GC 含量尽可能低于 60 %,酶切序列可以选择性加,如果加的话,可以方便后续的酶切鉴定。

        4. 做感受态转化实验时,注意重组质粒的体积不超过感受态的 1/10,否则实验可能失败。

        常见问题

        1. 胶回收的产物低,浓度不足以做连接时,可以增加实验的起始量,因为大部分胶回收试剂盒的回收率仅为 30%~60%,所以载体酶切和扩增片段时可以用 200 μl 的跑胶体积。

        2. 扩增的 PCR 产物无条带或者条带弱时,需要检查引物的 Tm 值以及 GC 比,可以更换引物或者改变 PCR 的条件,使其达到最优。

        3. 涂板后没有菌落或很少菌落时,可能是线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足或过量,或者比例不佳,也可能使用单酶切载体后,载体自连所致,建议使用双酶切法切割载体,防止自连。

        4. 菌液 PCR 无条带,可能是载体连接不成功,引物设计问题所致。

        来源:丁香实验

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