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常用发色底物一、产生水溶性产物的发色底物酶底 物简 称启始颜色终颜色吸收峰（nm）辣根过氧化物酶22’-乙基苯噻唑黄酸盐邻苯二胺33¢55¢-四甲基联苯胺ABTSOPDTMB无色无色无色绿色棕色黄色410492450碱性磷酸酶对硝基酚磷酸盐PNPP无色黄色405b-半乳糖苷酶邻硝基苯酚-b-d-吡喃半乳糖苷ONPG无色黄色410二、产生非水溶性产物的发色底物酶底 物简 称启始颜色终 ...

常用储存液的配制溶液配制方法注释PBS将8.0g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸馏水中，将pH调整至7.4，补充蒸馏水至1L，分装，高压灭菌，室温保存可配成10x储存液TBS将8.0g NaCl、0.2g KCl、3gTris，溶解于800ml蒸馏水中，用1mol/LHCl将pH调整至8.0，补充蒸馏水至1L，分装，高压灭菌，室温 ...

Tris缓冲液（TBS和THB）的配制（一）TBS的配制0.05 M TBS ( pH7.4 ) 的配制： Tris ( 三羟甲基胺基甲烷 ) 12.1g NaCl 17.5g 加蒸馏水

磷酸盐缓冲液（PB）的配制（1）A液（0.2M磷酸二氢钠水溶液）： NaH2PO4・H2O 27.6g，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。（2）B液（0.2M磷酸氢二钠水溶液）： Na2HPO4・7H2O 53.6g (或Na2HPO4・12 H2O 71.6g或Na2HPO4・2 H2O 35.6g ) 加蒸馏水溶解，加水至1000ml。（3）不同pH值磷酸盐缓冲液（PB）缓冲液 ...

细胞爬片、甩片的制备（一）细胞爬片的制备（1）如果使用载玻片或盖玻片，必须在使用之前灭菌。可以一次灭菌并贮存在无菌状态下。如果使用少量的盖玻片，用金属镊子夹住盖玻片，在70%乙醇中浸泡，然后在火焰上烤干。要轻轻地镊取，以防破裂。为了方便起见，可以将盖玻片浸泡于70%的乙醇中，使用时放在火焰上处理。如果使用的盖玻片或载玻片数量较多，可以将它们放于专用的金属支架上，然后高压消毒。如果需要的数量更大， ...

当纯净甲醛在水溶液中溶解时，会自动聚合成长链的多聚甲醛。其长度不一，在水中同时进行聚合与解聚反应。甲醛易溶于脂类物质，因此能穿过细胞膜进入细胞内。用多聚甲醛固定细胞时，能使细胞内的自由氨基基团发生化学交联。当不同的分子发生交联时，形成一网状结构，把细胞的各个结构成分连接起来。 单独用多聚甲醛固定细胞不能使抗体进入细胞内，在检测细胞内抗原时，标本经多聚甲 ...

用有机溶剂固定细胞爬片、甩片或切片 所有的固定方案必须做到：①防止抗原丢失；②维持细胞正常结构；③尽量使抗原保持能与抗体结合的状态。 常用的固定剂种类很多，固定剂的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。固定剂可分为两大类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂，如乙醇和丙酮能够去除脂类物质，使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接 ...

蛋白质定量（一）Bradford法 该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100SDSNP-40等。（1）Bradford染液配制：将100mg考马斯亮蓝溶于50 ml 95%的乙醇中，加入100ml 浓磷 酸，然后，用双蒸水补充至200ml，放4C至少6个月。这种染液也可从B ...

LAK细胞和TIL活性的测定 LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞，如Raji、Daudi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT比色法等。 在此介绍MTT比色法。【试剂及材料】（1） 试剂：①四甲基偶氮盐（MTT）；②酸化异丙醇:含0.04mol/L HCl的异丙醇；③96孔细胞培养板。 ...

乳酸脱氢酶释放试验测定NK细胞活性【基本原理】 乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞浆内含酶之一，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中.释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I（NAD+）变成还原型辅酶I（NADH2），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑 ...

51Cr释放试验测定NK细胞活性【基本原理】Na251CrO4能进入到增殖的细胞内，与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后，即可释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr，即可计算出NK细胞活性。【试剂及材料】（1） 铬酸钠（Na251CrO4）: 51Cr的物理半寿期为27.72d。（2） 十二 ...

LAK/TIL细胞的制备1、LAK细胞的制备【试剂及材料】①PHA②rhIL-2③20％NCS-RPMI-1640培养液【操作方法】（1）常规分离PBM或将正常人外伤摘除的脾脏按常规方法制备成单个脾细胞悬液，用含20％NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml；（2）将上述细胞加入24孔培养板孔中，同时加入60μg PHA，rhIL-2（终浓度为500U/ml），将细胞置 ...

凝胶染色（一）标准考马斯亮蓝染色法（1）电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。加入５倍于凝胶体积的0.25%考马斯亮蓝R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；（2）室温下振摇温育４ｈ至过夜；（3）去除染色液，收集保存可重复使用20-40次；（4）依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室温振摇下脱色。灵敏度为0.1-0.5ug蛋白／每条带。注：使用加热的染色液或脱色液可以缩短染色或脱色时间。 ...

125I-UdR释放试验测定NK细胞活性【基本原理】 125I-UdR（125I-2′脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶核苷的类似物，作为DNA合成的前体物，能相当特异地取代胸腺嘧啶核苷掺入到细胞核DNA链上。因此，可用125I-UdR标记体外传代培养的肿瘤细胞作为靶细胞，以外周血分离的单个核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞，进行体外NK细胞活性检测。被效应细胞杀伤的�靶细胞溶解后可释放125I-Ud ...

中性粒细胞粘附功能的测定【试剂及材料】（1） 尼龙纤维：粗3但尼尔，长4cm，200型。（2） 肝素抗凝血1ml（3） 硷性美蓝液【操作方法】（1） 取尼龙纤维70mg，塞入尖端直径为1mm左右的毛细吸管内15mm；（2） 将毛细吸管竖立于试管内，注入肝素抗凝血1ml，使之通过尼龙纤维；（3） 涂片并固定染色后（同 ...

中性粒细胞功能硝基蓝四氮唑（NBT）还原能力的测定【试剂及材料】(1) 0.1％明胶-Hanks液(2) 0.01mol/L KCN(3) 0.1％ NBT(4) 酵母多糖处理血清【操作方法】（1） 分离中性粒细胞，调整细胞浓度至107/ml；（2） 按下表依次加样：静止时NBT的还原能力激活时NBT的还原能力0.1％白明 ...

中性粒细胞移动功能的测定―琼脂糖平板法【试剂及材料】（1） 琼脂糖和明胶（2） 趋化因子（制备见附注）（3） Giemsa染液（4） 显微测微器【操作方法】（1） 称0.25g琼脂糖，加12.5ml蒸馏水，沸水内加热溶化，冷至47℃；（2） 另取Hanks液2ml，10％明胶25ml和蒸馏水8ml，混匀后加7％的NaHCO32滴；（3） 将二者混匀倒板。在琼脂板 ...

中性粒细胞吞噬功能的测定中性粒细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）的功能包括粘附、移动、吞噬杀菌等，是机体天然免疫力的重要组成部分。【试剂及材料】（1） 白色葡萄球菌（2） 肉汤培养基（3） 硷性美蓝液【操作方法】 （1） 菌液的制备 将白色葡萄球菌接种于中，放37℃温箱内培养12h左右；置 ...

中性粒细胞杀菌功能的检测―全血化学发光测定法【基本原理】 过氧化物生成系统在杀菌过程中起重要作用。中性粒细胞被激活时，其NADPH氧化酶亦被活化，发生氧化还原反应，形成过氧化离子，随后通过超氧化物歧化酶（SOD）将其转变为H2O2，参入细胞内杀菌。H2O2在过氧化物酶作用下，形成次氯酸和卤化物是另一种杀菌机理。过氧化离子不稳定，在其分解过程中可激活鲁米诺（氨基苯二酰-肼）类物质，并使之发生荧 ...

MTT法检测单核-巨噬细胞胞毒作用 单核-巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要的作用，因此，检测单核-巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。下面介绍几种常用的单核-巨噬细胞功能的检测方法。【试剂及材料】（1） LPS（2） 靶细胞（L929，K562或LL937）（3） MTT（5mg/ml）【操作方法】（1） ...