LAK细胞和TIL活性的测定

LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞，如Raji、Daudi或自体肿瘤细胞。常采用同位素法如51 Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT比色法等。 在此介绍MTT比色法。

试剂及材料

1. 试剂：①四甲基偶氮盐（MTT）；②酸化异丙醇：含0.04mol/L HCl的异丙醇；③96孔细胞培养板。

2. 肿瘤细胞系： Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。所有细胞株均培养在含10%～20%NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全工作培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20%NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×10⁶ /ml备用。

操作方法

1. 按上述方法分离LAK细胞或TIL，用含IL-2的20%NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5x10⁶ /ml；

2. LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1:1～20的比例分别取100μl接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。设不同浓度效应细胞200μl/孔单独培养测定效应细胞的吸光度。同时将不同的白血病细胞株分别用20%NCS-RPMI-1640培养液调整至3×10⁴～1×10⁵ /ml，取100μl细胞悬液和100μl培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度；

3. 将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO₂ 温箱孵育20h；

4. 于终止培养前，每孔加入MTT 10μl，混匀后再培养4～6h；

5. 吸弃上清液，每孔加入溶剂（DMSO）100μl，稍振荡待产物充分溶解；

6. 在酶标仪上，测定OD560nm ；

结果分析

细胞毒性百分率按下列公式计算：

ODE+T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值

ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值

ODT=相应浓度单独靶细胞的OD值