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        LAK/TIL细胞的制备

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        一、LAK细胞的制备

        试剂及材料

        1. PHA

        2. rhIL-2

        3. 20%NCS-RPMI-1640培养液

        操作方法

        1. 常规分离PBM或将正常人外伤摘除的脾脏按常规方法制备成单个脾细胞悬液,用含20%NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106 /ml;

        2. 将上述细胞加入24孔培养板孔中,同时加入60μg PHA,rhIL-2(终浓度为500U/ml),将细胞置37℃,5%CO2 条件下培养,2~3d换液一次。吸弃1/2上清,加入含100U/ml的重组人IL-2 20%NCS-RPMI-1640培养液,继续培养3d,收集细胞,即为LAK。

        二、TIL细胞的分离制备

        试剂及材料

        IL-2;RPMI-1640;Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、DNA酶;0.001%的透明质酸酶和DNA酶;80目和200目不锈钢网。

        操作方法

        1. 无菌切取肿瘤组织或肿瘤浸润的局部淋巴结,置于含抗生素的RPMI-1640培养液中;

        2. 将瘤体机械法剪碎,用RPMI-1640调整体积为10~20ml,同时加入0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶,室温搅拌4~6h;

        3. 依次用80目和200目不锈钢网过滤;

        4. 经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次,1500rmin离心5~10min;

        5. 用含5%NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞,将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加入试管底层,其上缓慢加入75%的淋巴细胞分层液(用RPMI-1640配制)然后缓慢加入上述肿瘤细胞悬液3~5ml;

        6. 经1500~1800r/min离心20min后,分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞;

        7. 用RPMI-1640洗涤2次,每次1500r/min离心5~10min。肿瘤细胞加入冻存液后液氮冻存备用。TIL则用含20%NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5×106 /ml;

        8. 将上述细胞悬液接种于24孔培养板(1ml/孔),同时分别加入IL-2 1000U/或IL-2和CD3 McAb 1μg/ml,置37℃,5%CO2 温箱培养3~4周,其间3~5d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液

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