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        51Cr释放试验测定NK细胞活性

        互联网

        20159

        基本原理

        Na251CrO4能进入到增殖的细胞内,与细胞浆蛋白质牢固地结合。当标记的51Cr细胞受到损伤或死亡之后,即可释放出51Cr。51Cr辐射γ射线,通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中的51Cr,即可计算出NK细胞活性。

        试剂及材料

        1. 铬酸钠(Na251CrO4):51Cr的物理半寿期为27.72d。

        2. 十二烷基硫酸钠(SDS):用无菌生理盐水配制成2%浓度。

        3. 靶细胞:检测人的NK细胞活性常用的靶细胞为体外传代细胞株K562。检测小鼠NK细胞活性常用的靶细胞是YAC-1细胞株。实验时一般采用24~48h培养的靶细胞。

        4. 效应细胞:从人外周血(肝素抗凝)分离的单个核细胞或小鼠脾细胞。

        5. 含15%NCS的RPMI-1640营养液及淋巴细胞分层液等。

        操作方法

        1. 靶细胞的制备:取培养24~48h的靶细胞2×106/0.5ml,加入100~200μci51Cr,置37℃水浴90min,每间隔15min振摇一次。然后用含5%NCS的RPMI-1640培养液洗涤三次,除去游离的51Cr。计数活细胞,用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105/ml,如暂时不用,可放置4℃冰箱内保存。同时应检测细胞的51Cr标记率,一般要求标记率>0.1cpm/细胞;

        2. 效应细胞的制备:常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞,用完全RPMI-1640培养液配制成1×107/ml的细胞悬液备用;

        3. 效―靶细胞作用:在无菌操作条件下,取效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1),加入96孔培养板内,每份标本做3复孔。同时设自然释放对照孔(0.1ml靶细胞+0.1ml完全RPMI-1640培养液)和最大释放孔(0.1ml 靶细胞+0.1ml 2%SDS),放置37℃、5%CO2温箱内孵育4h,取出后用微量移液器吸出各孔上清0.1ml,加于小塑料试管内(勿将细胞吸出),用γ计数仪测量cpm值;

        4. 结果计算:根据下式计算51Cr自然释放率和NK细胞活性:

        自然释放对照孔cpm均值

        最大释放对照孔cpm均值

        试验孔cpm均值-自然释放对照孔cpm均值

        最大释放对照孔cpm均值

        注:一般要求51Cr自然释放率<10%

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