全部

PCR反应体系的耐热DNA聚合酶 DNA的体外扩增是由许多不同来源的DNA聚合酶完成的。对PCR而言，热稳定DNA聚合酶（如Tag、Vent和pfu）优于热不稳定聚合酶（如T4、T7和Klenow），因为它们更易操作和实现自动化，其中以Taq DNA聚合酶的应用最为广泛。Taq DNA聚合酶的分子量为94kD这种酶不显示任何3，→5，核酸外切酶活性它的最适反应温度在75℃左右对95℃的变温 ...

1、变性温度和时间：模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。适宜的变性条件是95℃ 30s或97℃15s。变性不完全，DNA双链会很快复性因而减少产量。在变性中温度太高或反应时间过长会导致酶活性的损失。Taq　DNA聚合酶活性的半寿期:92.5℃为2h以上，95℃为40min，97℃为5min。 2、复性温度和时间：复性温度决定PCR的 ...

PCR反应体系的污染的对策 PCR可从痕量的DNA扩增出大量的DNA产物，由于它的高度敏感性，使PCR也特别容易受到污染。如果一对引物多次使用或以靶序列扩增产物的有无作为诊断的标准，那么必须消除污染以得到有意义的PCR结果。污染的DNA可能有三个来源：来自其他测试样品的DNA，来自实验材料如重组克隆的DNA，或者来自同一靶序列的前一次PCR的扩增产物。最后一种污染，通常称为“遗留”（car ...

PCR常见问题及处置 1、没有扩增产物形成： ①循环温度，特别是解链温度是否确切，注意PCR仪的指示温度是否与实际温度相符； ②引物的组成是否正确，有无二级结构的形成； ③聚合酶活性是否正常； ④反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃以上处理反应系统使其灭活； ⑤某些来源的DNA可能有较难去除的蛋白质成分抑制PCR系统用蛋白 ...

PCR反应体系的其他优化策略 1、增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG-6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清白蛋白（10～100μg/ml）等可以加到反应中以提高特异性和产量。有些反应只能在这些辅助物存在时才能扩增。2、热启动PCR：Tag酶在低温下仍有活性，当所有的反应成分混合后进入循环前，一些非特 ...

白细胞标本DNA PCR反应模板的制备 方法一 【试剂与配制】蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5TE缓冲液（pH7.5 或8.0）PBS（磷酸盐缓冲液）钾缓冲液：50mmol/L KCl10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12 ，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/m ...

细菌DNA PCR反应模板的制备 从分析的标本中纯化核酸，即制备PCR反应的模板，是使PCR获得成功的重要的第一步。由于PCR的用途各异，用于抽提核酸的起始材料种类可能差异很大（包括新鲜的、储存的和古代的）。每种特殊样品类型有各自的限制和抽提核酸的不同要求，但它们都有一个共同的标准，扩增的灵敏性要求特别注意不同材料、PCR产物、质粒或对照之间可能存在的交叉污染。由于PCR不需要高分子量和高 ...

全血标本DNA PCR反应模板的制备 【试剂与配制】蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5TE缓冲液（pH7.5 或8.0）PBS（磷酸盐缓冲液）钾缓冲液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)， 1%laureth12，0.5 ...

临床拭子标本DNA PCR反应模板的制备 此方法适用于各种拭子标本（鼻、咽、口腔和生殖道等）中DNA的快速制备。 【试剂与配制】PBS-2×Fungi-Bact液钾缓冲液：50mmol/L KCl10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml） 生理盐水无水乙醇T ...

固定和包埋的组织标本DNA PCR反应模板的制备 石蜡包埋组织和其他固定组织代表档案标本。由于PCR可以扩增相对于完整的染色体DNA来说较短的DNA片段，而且在一定程度上可接受降解的DNA，所以固定组织适用于分子遗传学研究。这些组织是前瞻和回顾性分子遗传学和感染疾病研究的巨大资源。大部分固定和包埋组织标本经福尔马林固定，分析前样品大多要进行脱蜡和水化，再用蛋白酶消化。 【试剂与配制】（ ...

微量和特殊标本DNA PCR反应模板的制备（一）血斑标本【操作方法】　（1） 将血斑剪碎置于试管中；（2） 加1.8ml TES液(含0.15mol/L NaCl10mmol/L Tris-HClpH7.51mmol/L EDTA)浸泡10min；（3） 加10％ SDS 180μl和蛋白酶K(10U)25μl50℃过夜；（4） 用等体积的饱和酚和氯仿各抽提两次；（5） ...

体外培养细胞和组织细胞DNA PCR反应模板的制备 1g哺乳动物细胞，可以得到约2mg DNA。【试剂与配制】（1）磷酸缓冲液；（2）酚/氯仿/异戊醇25:24:1；（3）7.5mol/L醋酸铵；（4）100％和70％乙醇；（5）TE缓冲液；（6）消化缓冲液：100mmol/L NaCl、pH8.0 10mmol/L Tris.Cl、pH8.0 25mmol/L EDTA、0.5％SDS ...

PCR产物的检测凝胶电泳分析法 用琼脂糖凝胶电泳来分辨和检测PCR产物是最简单，也是最常用的方法。根据寡核苷酸引物的位置可以预知产物的长度，所以在正确的位置上出现分离的条带通常表示反应是成功的。凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，监测扩增的情况，还可以用来纯化产物。PCR产物电泳分析中琼脂糖浓度片段大小（bp） 琼脂糖浓度 50～500 ...

凝胶中PCR产物再扩增标本PCR反应模板的制备 有时DNA模板来源较困难，如病毒核酸或cDNA，一次PCR成功后，要想多获得一些PCR产物，用原模板较浪费，此时可用凝胶中PCR产物作为模板，用低熔点胶回收后溶解直接用于PCR。【操作方法】（1） 用合适浓度（1%）的低熔点胶分离扩增产物；（2） 切下预期的产物，放于微量离心管中，可保存于4℃或立即溶解应用； ...

RNA标本PCR反应模板的制备（一） 血液单核细胞RNA制备（1） 用密度梯度法制备血中单核细胞；（2） 取出单核细胞用PBS洗2次，每次300g离心5min；（3） 洗后的单核细胞沉淀用200～400μl含0.5% NP-40的预冷的IHB（0.01% DEPC配制）重新悬起；（4） 离心10sec沉淀细胞核，若有必要，可收集细胞核DNA，但应洗去DEPC；（5） 将上 ...

点杂交膜的制备 当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。通过将PCR 产物固定于尼龙膜和硝酸纤微素膜上，再用标记的探针进行点杂交。点杂交可检测突变DNA的突变类型，而应用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。 方法有二：一是将PCR产物固定至膜上，液相中的探针与其杂交；二是将多种探针固定于同一膜上不同区域，再与液相中的PCR产物杂交，根据阳性位置即可判断产物的类型。1．PCR产物的固定 ...

PCR产物的检测点杂交1．寡核苷酸探针杂交 【试剂与配置】 预杂交液：5×SSC，5×Denhadrt 0.5%Triton X-100 2×SSC/0.1%SDS 1×SSC/0.1%SDS 0.1×SSC/0.1%SDS 【操作方法】 (1) 将2×SSC湿润的杂交膜放入50ml试管中，再加入5～10ml预杂交液，盖上盖子； （2）置于杂交炉中，在杂交温度下（比探 ...

PCR产物的检测PCR-ELISA法 在一个引物的5’端标记上生物素以便使其能与包被板上的亲合素结合而固定PCR产物，而在另一引物的5’端标记FITC，用HRP标记的抗FITC抗体与之结合显色，即可进行常规ELISA检测。如设立标准对照，此技术还可用于定量分析。【试剂与配置】 包被液：4.3mmol/L Na2HPO4 1.4mmol/L K2HPO4 0.05% (w/v) Twee ...

点杂交的检测 现在大多数的实验室里，常用的标记物为地高辛和生物素，下面主要介绍这两种标记系统的显色方法。1． 地高辛标记探针和PCR引物【试剂与配置】缓冲液Ⅰ：150mmol/L NaCl 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)缓冲液Ⅱ：0.5%阻断剂溶于缓冲液Ⅰ缓冲液Ⅲ：100mmol/L NaCl 100mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，50mmol/ ...

免疫PCR(IM-PCR) 免疫PCR是将抗原抗体反应的特异性与体外扩增DNA的技术相结合用于检测生物样品中含量极少的蛋白质，如细胞因子，微量抗原等的方法。首先由Sahot等用重组的链霉亲合素和A蛋白的嵌合体，将免疫法和PCR结合在一起而形成。其基本原理和酶联免疫固相检测法(ELISA)一样只是标记物质为一段特定的DNA，并且通过PCR扩增进行检测。为此它要比ELISA敏感10万倍敏感 ...