点杂交膜的制备

当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。通过将PCR 产物固定于尼龙膜和硝酸纤微素膜上，再用标记的探针进行点杂交。点杂交可检测突变DNA的突变类型，而应用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。

方法有二：

一是将PCR产物固定至膜上，液相中的探针与其杂交；

二是将多种探针固定于同一膜上不同区域，再与液相中的PCR产物杂交，根据阳性位置即可判断产物的类型。

1．PCR产物的固定

[试剂与配置]

TE缓冲液
变性液：0.4mol/L NaOH，25mmol/L EDTA

[操作方法]

(1)按点样器的大小裁减尼龙膜，并作好标记(在一角剪去一块)，去离子水中浸泡1min；

(2)5～20μl(50～100ng)PCR产物中加入100μl变性液混匀，室温作用5min；

(3)小心将预湿的膜置于点样器上，注意接触面不能有气泡，预抽5min；

(4)每孔中加入样品后，抽吸5min，再加100μlTE洗涤每孔，抽干水分；

(5)取下膜，置于滤纸上渍干；

(6)渍干的膜于80℃真空干烤1h或于离紫外灯10cm处照射3min，使DNA固定于膜上；可立即使用或保存于塑料袋中。

2．探针的固定

寡核苷酸探针较难固定于膜上，需将其用末端转移酶加poly dT尾后，经UV照射(可激活胸腺嘧啶与尼龙膜上的氨基结合)后固定于尼龙膜上。

[试剂与配置]

10×TdT缓冲液：1mol/L二甲砷酸钾，250mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 10mmol/LcaCl, 2mmol/L DTT。
dTTP.
10mmol/L EDTA
0.3mol/L NaOH
2.5mol/L乙酸铵
6×SSC
0.5% SDS

[操作方法]

(1)在一微量离心管中依次加入：寡核苷酸探针100～200pmol，10×TdT缓冲液10μl，dTTP 100nmol，TdT 60U，补去离子水至100μl，混匀后短暂离心，37℃保温60min；

(2)加入100μl 10mmol/L EDTA终止反应，可取小量在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检查加尾长度(400个以上为佳)；

(3)用0.3mol/L NaOH室温处理6pmol加尾探针5min，再用2.5mol/L乙酸铵中和；

(4)加入等体积的6×SSC；

(5)将用6×SSC预湿的膜固定于点样器上，点样方法同前；

(6)小心取下膜，置于TE缓冲液饱和的滤纸上，DNA面向上，紫外灯下固定5min；

(7)将固定的膜置于100ml 6×SSC/0.5%SDS溶液中，42～55℃漂洗30min；可立即用于杂交，也可以在蒸馏水中浸洗，晾干后室温保存。