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        PCR常见问题及处置

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        PCR 常见问题及处置
         
            1、没有扩增产物形成:
            ①循环温度,特别是解链温度是否确切,注意PCR仪的指示温度是否与实际温度相符;
            ②引物的组成是否正确,有无二级结构的形成;
            ③聚合酶活性是否正常;
            ④反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在,使聚合酶或模板及产物降解,可在95℃以上处理反应系统使其灭活;
            ⑤某些来源的DNA可能有较难去除的蛋白质成分,抑制PCR系统,用蛋白酶K重新处理即可。
         
            2、非特异性产物的出现:
            ①提高退火温度,缩短退火或延伸时间;
            ②调整引物,Taq DNA聚合酶或模板;
            ③调整Mg2+用量;
            ④减少热循环次数。
         
            3、引物二聚体的形成:
            ①检查引物的序列,特别是在3端是否有互补区;
            ②提高退火温度;
            ③调整引物与模板浓度,使模板比例增高;
            ④增加引物长度;
            ⑤减少热循环次数。
         
            4 、预防假阳性结果:设置一系列对照,如
            ①阳性对照:应用已知阳性模板;
            ②阴性或空白对照:加无关或不加模板DNA;
            ③重复试验:重要的实验结果要反复验证,下结论要慎重。
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