PCR常见问题及处置
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PCR 常见问题及处置
1、没有扩增产物形成：
①循环温度，特别是解链温度是否确切，注意PCR仪的指示温度是否与实际温度相符；
②引物的组成是否正确，有无二级结构的形成；
③聚合酶活性是否正常；
④反应系统有无蛋白酶或核酸酶的存在，使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃以上处理反应系统使其灭活；
⑤某些来源的DNA可能有较难去除的蛋白质成分,抑制PCR系统,用蛋白酶K重新处理即可。
2、非特异性产物的出现:
①提高退火温度,缩短退火或延伸时间；
②调整引物，Taq DNA聚合酶或模板；
③调整Mg2+用量；
④减少热循环次数。
3、引物二聚体的形成:
①检查引物的序列，特别是在3端是否有互补区；
②提高退火温度；
③调整引物与模板浓度，使模板比例增高；
④增加引物长度；
⑤减少热循环次数。
4 、预防假阳性结果：设置一系列对照，如
①阳性对照：应用已知阳性模板；
②阴性或空白对照：加无关或不加模板DNA；
③重复试验：重要的实验结果要反复验证，下结论要慎重。
