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        临床拭子标本DNA PCR反应模板的制备

        互联网

        2073

        此方法适用于各种拭子标本(鼻、咽、口腔和生殖道等)中DNA的快速制备。

        试剂与配制

        PBS-2×Fungi-Bact液;生理盐水;无水乙醇;TE缓冲液;钾缓冲液:50mmol/L KCl,10~20mmol/L Tris-Cl,2.5mmol/L MgCl(pH8.3),1%laureth12,0.5% Tween-20,蛋白酶K(100μg/ml);

        操作方法

        一、采样:

        1. 用无菌生理盐水润湿消毒的棉签蘸取鼻、咽、口腔和生殖道等表面的上皮或感染的表面,将沾有标本的棉签置于2mlPBS-2×Fungi-Bact液中。如样本在24 hr内处理,可室温保存,否则存于4℃;

        2. 动物组织用生理盐水漂洗一次,切成宽度小于1cm的小片,用等体积的生理盐水悬起,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%,室温下可保存数日,4℃可保存数年;

        3. 肝素或柠檬酸抗凝血室温保存1~2d后仍能进行DNA分析,保存用于DNA分析的血样品的较理想的,也是最简单的方法就是将血涂于玻片上干燥保存。100μl血涂片含有5×10 个细胞,相当于3μg哺乳动物细胞核DNA。

        二、DNA的制备:

        1. 2000rpm离心10min,沉淀细胞;

        2. 弃上清,如有残留的血液,则再用1mlTE缓冲液悬起细胞沉淀并转移至Ep管中,10000g离心30s,沉淀完整的细胞;

        3. 除去上清(内含有红细胞裂解成分),如仍有残留血液,可重复(2)和(3)直至沉淀细胞无红细胞痕迹为止;

        4. 用50~300μl钾缓冲液悬起细胞沉淀,使细胞浓度为10~1000个细胞/μl;

        5. 55℃保温1hr,消化裂解细胞,释放DNA;

        6. 95℃保温10min,灭活蛋白酶K;

        7. 处理的样品可储存于-20℃。

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