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        免疫PCR(IM-PCR)

        互联网

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        免疫PCR是将抗原抗体反应的特异性与体外扩增DNA的技术相结合,用于检测生物样品中含量极少的蛋白质,如细胞因子,微量抗原等的方法。首先由Sahot等用重组的链霉亲合素和A蛋白的嵌合体,将免疫法和PCR结合在一起而形成。

        其基本原理和酶联免疫固相检测法(ELISA)一样,只是标记物质为一段特定的DNA,并且通过PCR扩增进行检测。为此,它要比ELISA敏感10万倍,敏感性可达几百个待检分子。按反应中所用抗体的方式不同可分为:

        1. 直接IM―PCR法:将所测抗原吸附在固相载体上,使特异性单抗与之反应,然后用生物素化的多抗通过亲合素与生物素化DNA(标记分子)相连接,再用适宜的引物将后者进行PCR。敏感性可达15pg。

        2. 间接IM-PCR(双抗体夹心IM-PCR):此法用于难以直接吸附于固相载体的抗原检测。将与被检物对应的McAb先吸附在固相载体上,然后使被检抗原与之反应。再用生物素化的特异性多抗结合此抗原,通过亲合素再与生物素化DNA相连接,然后以适当的引物对DNA指示分子进行PCR扩增。

        由于此法是以扩增的DNA量来反映待检抗原的量,所以要用不同浓度的标准抗原同时进行PCR,以获得标准抗原(根据生成DNA量计算)的剂量反应曲线,然后从标准曲线上读取待检抗原量。

        PCR扩增产物的测定,一般是用2%琼脂糖凝胶进行电泳,然后按DNA合成时所掺入的同位素脱氧核糖核苷酸的放射性,或者按DNA被溴化乙锭(EB)染色的程度来判定。Mantero等(1991)发展了DNA的酶免疫分析法(DEIT)。

        此法是用一个吸附亲合素的固相载体,去结合带有生物素的特异性寡核苷酸探针。于是可将所得的变性PCR产物与之杂交。然后用一种能区别单链和双链DNA的单克隆抗体,使其与双链DNA发生反应。然后用酶标羊(或兔)抗鼠IgG抗体及相应底物进行显色。使用这一方法,可检测出单个抗原分子。

        材料与试剂包括:

        ①所测物的单克隆抗体(鼠);

        ②所测物的多克隆抗体(兔);

        ③生物素化羊抗鼠IgG;

        ④生物素化羊抗兔IgG;

        ⑤生物素化dUTP;

        ⑥Klenow聚合酶;

        ⑦PCR反应液;

        ⑧引物(自行设计);

        ⑨生物素化DNA标记分子。

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