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ws 各位站友，本人因克隆某个植物抗病基因而完成了其BAC文库，目前正在做图位克隆的工作。但文库的完成耗费了大量人力、物力和财力，因此想请教下该库还有什么其它用途。或与其它技术结合，可开展什么工作。谢谢了。。。。zhujoker BAC (Bacterial Artificial Chromosome, 细菌人工染色体)文库是进行全基因组测序、构建物理图谱、染色体步查、基因筛选及图位克隆有益基因的最好材料，也是永久保存基因资源的最好方法之 ...

owen79 各位大侠好，小弟愚问一下，我想测定NF-KB活化后细胞核内的量，这需要提取核蛋白，但是蛋白量太少，提取出来能否测出NF-KB啊！thank you !ronaldo_zj 1. 通过提取细胞核、细胞浆内的蛋白来行western blot检测NF-kappa B 的表达情况是可以的，因为很多时候是通过NF-kappa B转位来实现活化的，所以提取的时候我不知道楼主是自己配制试剂提取还是用试剂盒提取的，我建议可以将2-3皿细胞（当然是相同的 ...

xuemei1984 新手求助定点突变，想要将原序列中转录因子的结合基序突变掉，有的文献是将核心区的碱基置换掉，而有的文献是将核心区的碱基删除，请问究竟是要选择删除还是置换呢？那种相对比较好一些？十分感谢！woxingwosu 感觉置换掉比较好，比较有说服力，文献上采用较多的还是将核心区的碱基置换掉。xuemei1984 woxingwosu wrote:感觉置换掉比较好，比较有说服力，文献上采用较多的还是将核心区的碱基置换掉 ...

saga2230 最近一周做的rt-pcr实验，动物肝组织提取RNA。结果β-acitn出现了杂带。这是第4次重复的结果，之前的结果都很好，只是这次有杂带。可能是样品放置时间过长了，肝组织在-40冰箱里未加其他试剂放置20天左右。其中的原理好像很复杂，这个我没有专门学习过。问了周围人，有3种说法，1二聚体，2特异结合，3杂dna引入，但都说的不清楚，只是说有可能是这样的。。谁能帮忙分析下是什么原因啊。。。westernblo ...

qisanni05 请教各位大侠，为什么我在MiRbase上找不到hsa-mir-150 基因上下游序列呢，请各位高手帮忙找一下，十分感谢！qisanni05 这是什么意思啊，由于刚涉及这方面还不太懂，还请高手多指教，非常感谢！lide658 你是要找编码hsa-mir-150的序列吗？如果是想构建hsa-mir-150表达载体，在MiRbase上是找不到的，你只能找到hsa-mir-150的成熟序列或者是前体序列。但是你可以直接在 ...

sn党参 请问我将细胞离心后加入细胞裂解液后变得黏黏的，能拉出丝是怎么回事呢，细胞是K562/a.，裂解液是tris，SDS（0.4g),定容至100ml，用时加酶抑制剂sn党参 此外请问我要研究的是细胞膜蛋白，请问需要离心吗，有说法说离心后膜蛋白是在沉淀里面的，请问离心是为了去除核酸吗，如果不去除，会有什么影响，谢谢xhjggl 黏黏的是完整基因组的缘故，可以超声或匀浆，提取膜蛋白，可以用以下产品本文由丁香园论坛提供，想了解更 ...

yellowtree 各位大虾，我目前使用PI3K抑制剂LY294002，MEK抑制剂PD98059，JAK抑制剂AG490处理细胞后，要观察他们的抑制效果，那我该买什么抗体做western检测呢？每个信号通路都有那么多蛋白，应该选择哪一个呢。谢谢各位啦kern6549 抑制什么蛋白就检测什么蛋白。mishmoth 检测下游分子，如pPI3K的下游是Aktaileen83 一般是检测下游蛋白，如果下游蛋白因为抑制剂处理而未 ...

郭琼926 大家好！初次过来请多指教！现在准备做RNA干扰（应该也可以叫miRNA技术吧？），我有些许问题还不明白？1 想把实验中的目标基因沉默，可以先通过软件设计序列，会有好几个备选序列，那么如何选择？请推荐好用的设计软件!!!2 如果序列选择好了，现在要转入细胞内来沉默目标基因，如何转入？我看了一些文献，几乎都用的是Lipfectamine2000,但最后沉默的时间不会太长，大概3-4天后目标基因的表达又会恢复，感觉这种方法沉 ...

大鹏鸟 使用了sigma的mission系列的慢病毒做干扰，用non-target作为对照，但是发现除了目的基因，对照与空白细胞变化不大以外，其他检测的几个基因对照和空白相比，变化都很大，这是为什么呢？除了off target效应以外，还有什么可能性？那我处理数据的时候，实验组到底是以空白作为对照好呢，还是以non-target作为对照好呢？吴佰霖 以non-target作为对照好因为target及non-target都是往 ...

jiangningforever 最近想做miRNA功能抑制相关实验，想请教高手针对多个microRNA分子的家族，inhibitor 应当怎么选择？路得自己走 同一AMO序列target不同的miRNAs，希望对楼主有用！另外，是不是可以联合应用针对不同miRNAs的inhibitor呢！网络慢，传不上全文Nucleic Acids Res. 2009 Feb;37(3):e24. Epub 2009 Jan 9.A single anti-microRNA ant ...

jianming120 microRNA(miRNA)是一类保守、短序列、单链的非编码小分子RNA，通过与靶基因mRNA特异性的结合而导致靶mRNA降解或抑制其翻译，调控蛋白编码基因的表达，在个体发育以及细胞的分化、增殖、凋亡、应激等生物学过程中发挥重要的作用。正是microRNA(miRNA)通过RNA介导的沉默复合体（RNA induced silence complex，RISC)使靶基因mRNA降解或抑制其翻译，而通过预 ...

zx13763431 小弟新人，现在**犬类TGF-β1mRNA和内参照β-actin基因大小（bp数）？？小弟谢过了~把引物序列放在下面。谢谢各位大虾~~TGF-β1引物上游引物序列为:5’-GCTCCACGGAGAA-GAACAGGCTG-3’，下游引物序列为: 5’-CTGCTCCAC-CTTGGGCTTGC-3’；内参照β-actin引物上游引物序列为：5’GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’，下游引物序列为: 5’CTC ...

viola2010 您好，我是新手，我想在细胞中导入wnt1基因，希望基因导入后能够稳定表达，在参考文献上看到HA-tagged Wnt1 expression vector (pHA-Wnt1），是如何构建的？怎样转染进入细胞？其中PHA其中是什么？质粒吗？还是。。。chenhaombb PHA是质粒。先得到目的基因，再连接到载体上，转染即可woxingwosu 更确切的说，pHA应该是一个带有HA的标签（tag）的载体（可能是作者自己构建的）， ...

xxzjcg 请教构建载体，插于片段670bp，pcDNA3.1质粒5400bp，如果10ul连接体系，插于片段加多少？pcDNA3.1加多少？woxingwosu pcDNA3.1：片段约为1：3至1：4，其他的成分按照要求来做。xxzjcg 可是我做了1：4加的，长出几个菌，但菌落PCR是阴性的，请教可能什么原因cixinkejian 确认下你的酶切位点；直接克隆虽然省事，但是还不如先走T载体克隆，然后再连接到你的目的载体上了！r ...

shengmaolin 各位大侠，小弟有个问题想请教。NF-KB p65能不能做RT-PCR？怎么在Pubmed的Nucleotide上找不到人的NF-KB p65的核苷酸啊！找一个药商帮设计的上游引物：5’- GGGATGGCTTCTATG-3’ 下游引物：5’- GTTTCGGTTCACTCG-3’，查了下好像不对。到底怎么搞的我也不清楚，请各位老师指点！谢谢！shengmaolin 帮帮忙，大侠们！brucewu1986 是不是人的p65啊p65 ...

minnie_pumc 各位战友，大家好，我想请教个问题，在构建重组腺病毒载体时是不是必须先构进T载体中呢？谢谢！westernblotx 不是一定非要克隆到T载体，你也可以选择直接进行PCR产物酶切（注意引物设计两端的酶切位点选择和保护碱基），然后连接到你需要的目的骨架上。个人认为，我们用T载体主要是因为它作为中间克隆载体，相对比较容易操作，尽管想起来会觉得多了中间步骤，但是每一步都容易验证（比如克隆的片段需要测序是否 ...

mcstudent 我打算找mir-155的靶基因，在网站上是这样的，求高人指导：在http://www.mirbase.org/网站上输入file:///C:/Documents%20and%20Settings/Administrator/Application%20Data/Tencent/Users/270756706/QQ/WinTemp/RichOle/XQ0~4MD6R67KP$7R%7B%60~7E.jpg这时候我是不 ...

fengtingting2010 小鼠T细胞中beta-Actin的含量是多少啊，我要算小鼠T细胞中Foxp3的含量，如何知道呢？还有Western blot的抗体最适的稀释度如何确定，是全部做完后，拍片才能确定吗？一般加的抗体的体积是固定的吗？是10ul吗？fengtingting2010 如果上样量是20ug，体积是10ul。一抗和二抗的稀释度和体积如何确定呢？如何知道目的蛋白的丰度？万一目的蛋白的量仅在ng级别怎么办 ...

vera21173 我研究的是一个基因对肿瘤细胞增殖的影响，上调这个基因的表达可以促进细胞增殖（CCK-8和平板集落形成实验的结果一致），下调这个基因的表达可以抑制细胞增殖。但有平板集落形成实验有一个奇怪的现象，稳转这个基因的细胞集落形成数量明显比空载细胞多，但集落大小比空载细胞小很多，镜下观察发现空载细胞形成的集落中的细胞很分散，而稳转目的基因的细胞集落中细胞很紧密。请问这能说明什么问题？zhouyongchu ...

hedashan 实体瘤做细胞周期分析有意义吗？我想做中药抗肿瘤的体内实验，观察药物对细胞周期有无影响，疑问是取移植瘤的一小部分做细胞周期分析能代表整个瘤块的增殖状况吗？急，万分感谢！hedashan 补充一下，是小鼠Lewis肺癌移植瘤zhujoker 原代培养是可以的hedashan 谢谢！我是菜鸟级的，对分子生物学不了解，从通常的观点看，实体瘤中（小鼠Lewis肺癌移植瘤）细胞的增殖是非同步的（好像有的书中说恶性肿瘤细胞 ...