• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        【求助】请教构建载体

        丁香园论坛

        1951
        请教构建载体,插于片段670bp,pcDNA3.1质粒5400bp,如果10ul连接体系,插于片段加多少?pcDNA3.1加多少?
        pcDNA3.1:片段约为1:3至1:4,其他的成分按照要求来做。
        可是我做了1:4加的,长出几个菌,但菌落PCR是阴性的,请教可能什么原因
        确认下你的酶切位点;

        直接克隆虽然省事,但是还不如先走T载体克隆,然后再连接到你的目的载体上了!
        首先,确定一下你的片断浓度,根据你这个片断大小应该不难连接。 注意片断纯化质量, 如果含有乙醇可能不好连接。 重要的是,你应该按照片断的摩尔比去优化,而不是片断的质量比。载体用50ng 应该就足够了,以这个量去计算你加入连接片断的量大概至少需要18.6ng。如果是单酶切的话,可能是载体去磷酸化不彻底,如果是双酶切可能是残余的未完全切割的载体。当然也不排除被污染, 毕竟切胶过程中很容易被污染。
        你讲的不是很清楚。

        首先你是直接拿pcr产物,做克隆的,还是先做了TA克隆。

        先做TA克隆,产率比较高一点。

        你所说的插入片段与载体的比例。首先要看它的浓度亮度什么的。

        如果你是用单酶切连接的话,建议你适当的提高插入片段的比例。

        如果是双酶切的话,比例并不是很重要
        片段:载体=1:3
        4:1比较好。

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

        【求助】请教构建载体

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序