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        【求助】表达载体构建

        丁香园论坛

        2239
        您好,我是新手,我想在细胞中导入wnt1基因,希望基因导入后能够稳定表达,在参考文献上看到HA-tagged Wnt1 expression vector (pHA-Wnt1),是如何构建的?怎样转染进入细胞?其中PHA其中是什么?质粒吗?还是。。。
        PHA是质粒。先得到目的基因,再连接到载体上,转染即可
        更确切的说,pHA应该是一个带有HA的标签(tag)的载体(可能是作者自己构建的),wnt1基因通过克隆、酶切以及连接到这个载体的多克隆位点从而使得HA和wnt1能够在转染后融合表达。转染的方法多种多样,钙转、脂质体、PEI等等都可以,反正商业化的转染试剂很多的,甚至于病毒感染。如果这个载体上带有筛选标记,比如neo,就可以通过G418进行筛选从而获得稳定表达wnt1的过表达细胞株。
        谢谢啊
        请问常用与载体连接的标签有哪几种?标签是购买还是自己做?我想用lipo2000转染使wnt1导入目的细胞,逐步筛选等到稳定表达wnt1的细胞系可以吗?
        你好!标签有很多种,最主要是要看你喜欢用什么标签,如His,FLAG等,标签是你在做克隆的时候加上去的,但Anti-His或Anti-FlAG的抗体要自己去购买的,如果载体上有抗生素的筛选标记,如Neomycin,Blasticidin等,就可以用抗生素去筛选稳转细胞株,如果没有的话,可能只能用慢病毒或逆转录病毒来做了,一般来说用病毒来做稳转细胞株效率要比质粒瞬转高100倍以上。junhuang@biowit.com
        其实可以找分子生物学公司做的

        本文由丁香园论坛提供,想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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