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        cDNA第一链的合成

        互联网

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        通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后,变可进行cDNA第一链的合成,其步骤包括:

        1)在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl(10μg),100m mol/L甲基氢氧化汞1μl,室温反应l0分钟,使RNA变性。
        2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl,室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。
        3)向上述反应混合物加lmg/ml的引物01igo dT(12~18聚体)10μl,1mol/L Tris.HCl(pH8.3)5μl,11mol/L KCl7μl,250m mol/L MgCl22μl,再加20 m mol/L的4种dNTP各2.5μl,逆转录酶2μl(40单位),用水补充到50μl,充分混匀,42℃反应1~3小时。
        4)加0.5 EDTA(pH8.0)2μl终止反应,然后加150m mol/L NaOH 25μl,65℃反应1小时,或37℃8小时,水解mRNA模板,得到cDNA第一链,再加pH8.0,1m mol/L Tris.HCl,各25μl中和其pH。
        5)测定放射活性,计算合成的DNA量。实际上,cDNA第一链的产量往往不会超过poltAmRNA用量的10%~30%。
        6)用等体积的酚-氯仿抽提—次,取水相并用SephadexG-100离心柱层析(参看第6章)将cDNA同剩余的dNTP分开,以2.5倍体积的95%冷乙醇沉淀。
        7)合成的cDNA第—链在1.4%的碱性琼脂糖凝胶上电泳,用末端标记的pBR322限制性片段为分子量标准,电泳后,铺X-光片,进行放射自显影,确定cDNA第一链的大小。

         

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