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        如何解决合成cDNA第一链合成的引物退火不充分?

        相关实验:分子生物学实验

        user-title

        土井挞克树

        如何解决合成cDNA第一链合成的引物退火不充分?

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        3 个回答

        user-title

        cherish1100

        有帮助

        可以适当的改变退火温度,高或者低2度

        user-title

        sswei

        有帮助

        确定退火温度适合实验中所用的引物,如随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10 min。

        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        引物退火不充分可能会导致合成cDNA的第一链长度不足或者产量低,影响后续实验的结果。以下是一些解决方法:

        改变引物退火的温度和时间:引物的退火温度和时间是影响引物结合效率的重要因素。如果引物结合效率低,则需要增加引物退火的温度和时间。需要注意的是,引物退火温度不能太高,否则会破坏RNA模板的完整性,影响cDNA的合成效率。

        优化RNA模板的浓度和质量:RNA模板的浓度和质量也会影响cDNA的合成效率。如果RNA浓度太低或者质量不好,则会影响引物的结合效率和cDNA合成的产量。因此,可以考虑调整RNA的浓度和使用高质量的RNA样本。

        增加反应时间:如果引物结合效率较低,可以尝试延长反应时间来增加引物与RNA的结合和cDNA合成的时间。需要注意的是,反应时间也不能太长,否则可能会导致cDNA的二次结构形成和RNA降解,影响合成效率。

        更换引物:如果引物的结合效率一直较低,可以考虑更换引物。需要选择合适的引物序列,确保引物与RNA模板的匹配度高,并且引物不会出现自身二聚体或者交叉反应等问题。

        总之,针对引物退火不充分的问题,需要进行综合考虑和优化反应条件,以提高cDNA的合成效率和产量。

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