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        单链 cDNA 的合成实验

        相关实验:单链 cDNA 的合成实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        去除 RNA 酶的双蒸水

        10XRT-PCR 缓冲液(去除 RNA 酶的双蒸水,100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

        2. 酶和酶缓冲液

        MMLV 逆转录酶(100~200U/ul)

        SUPERaseINRNA 酶抑制剂(20U/ul;Ambion)

        3. 核酸和寡核苷酸

        dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)

        随机引物(5umol/L)

        总 RNA(达到 2.5ug)

        4. 实验器材

        薄壁的 PCR 管

        二、方法

        1. 在冰上加 2ul50umol/L 的随机引物到薄壁的 PCR 管中(一个反应一管)。

        2. 加入 2.5ug 的总 RNA。

        3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。

        4. 添加去除 RNA 酶的双蒸水(RNaSe-freeH20),使体积达到 16ul。

        5.70°C 加热 10min, 变性二级结构,然后立即放在冰上。

        6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。

        7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。

        8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。

        9.42°C 温浴 1h。

        10.95°C 加热10min, 灭活逆转录酶。

        11. 继续扩增步骤或停止反应,-2°C 储存。

        来源:丁香实验

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